Advances Towards Integrated Management of Fungal Grapevine Trunk Diseases

Abstract

[Abstract] Grapevine trunk diseases (GTDs) are among the main biotic threats to the economic sustainability of the grapevine industry worldwide, reducing yields, productivity and longevity of vineyards. Several factors such as changes in vineyard cultural practices, low sanitary quality of the grapevine propagation material, the ban of most effective chemical active ingredients, and poor protection of pruning wounds have increased their incidence over last years. Moreover, these diseases are very complex and involve a broad spectrum of taxonomically unrelated fungi making their control very challenging. In this thesis, the development and implementation of novel molecular techniques that lead to the improvement of practical effective strategies to the GTD management were investigated. The assessment of sustainable alternatives to the use of fungicides to increase vineyards lifespan was also performed. Initially, we comparatively assessed the accuracy, efficiency, and specificity of Droplet Digital PCR (ddPCR) and real-time PCR (qPCR) techniques for the detection and quantification of Ilyonectria liriodendri in bulk and rhizosphere soil, as well as, grapevine endorhizosphere obtained from healthy young vines in La Rioja region. The results revealed a strong correlation between both techniques with ddPCR being more sensitive to very low pathogen concentrations. Roots of asymptomatic vines were found to be a microbial niche that is inhabited by black-foot disease pathogens. Then, the spatial dynamics of the fungal communities of these three soil-plant compartments were also characterized by high-throughput amplicon sequencing (HTAS). Soil fungal assemblages had extensive local homogeneity across small distances, and soils with similar climatic and edaphic variables, thus suggesting that vineyard fungal communities are partially conserved in La Rioja region. The diversity and composition of the fungal communities were largely affected by the soil-plant compartment, with diversity decreasing in the endorhizosphere and suggesting that the root tissues entail a barrier for fungal colonization. The results of functional prediction suggested an increase in the relative abundances of potential plant pathogens, endophytes and arbuscular mycorrhiza, and a decrease in the relative abundance of potential wood and/or dung saprotrophs were predicted from bulk soil towards the endorhizosphere. Once more, it was found that the internal root tissues of asymptomatic vines are a microbial niche that is inhabited by GTD fungi. Abstract xiv The HTAS technique was also used to determine the effect of pruning time on the fungal microbiome diversity and composition that colonized pruning wounds naturally over two infection periods (November-February and February-May), in vineyards belonging to three Denominations of Origin (D.O.) in Galicia (Spain). The fungal communities colonizing grapevine pruning wounds were affected in their composition and diversity by the D.O., whereas the spatial variation within each region was low. The results showed the existence of a core community of fungal species conserved in grapevine pruned canes regardless of the infection period. Higher abundances for most GTD genera were detected after pruning in February (winter) than in November (mid-autumn), therefore suggesting a seasonal effect on pruning wounds infections. Additionally, a positive correlation was observed between the accumulated rainfall and the abundance of the total fungal microbiome and Diaporthe genus over eighth and eleventh weeks after pruning. Planting tolerant grapevine cultivars is one of the alternatives to the use of fungicides in controlling GTDs. The tolerance to Phaeomoniella chlamydospora infection of commercial and minority grapevine cultivars from Spanish germplasm collections was evaluated in a rapid and effective detached cutting assay under greenhouse conditions. All cultivars developed internal wood lesions after artificial inoculation with the causal agent of Petri disease and esca, indicating that there is no evidence of qualitative resistance to this fungus. Nevertheless, the severity of internal wood symptoms varied considerably amongst cultivars allowing to classify them according to varying signs of partial tolerance to Pa. chlamydospora. The cultivars ‘Estaldiña’, ‘Albillo Mayor’ or ‘Castañal’ were classified as the most tolerant based on mean lengths of wood discolouration. No foliar symptoms were observed on artificially inoculated plants during the experiments. Regarding disease management strategies, we assessed the effect of several biocontrol agents (BCAs) applied as root treatments at pre- and post-planting to control natural infections caused by black-foot and Petri diseases fungi, and their influence in plant growth parameters. Results showed that BCA effectiveness was dependent on the plant age and the plant part analyzed in reducing the incidence and severity of both diseases. Under specific scenarios, Streptomyces sp. E1 + R4 significantly reduced Dactylonectria torresensis and D. macrodidyma (black-foot) infections, while Pythium oligandrum Po37 and Trichoderma spp. significantly reduced Pa. chlamydospora and Phaeoacremonium minimum (Petri disease) infections. BCAs treatments significantly reduced root weight with respect to the control while no effect was observed on the shoot weight. Abstract xv Finally, we comparatively evaluated the efficacy of various fungicide and BCA formulations registered in Spain to act as pruning wound protectants against Diplodia seriata and Pa. chlamydospora, in the two vineyards of the D.O. Valdeorras (Galicia, Spain). Results showed that BCA-based treatments were less effective than fungicides. The commercial formulation containing pyraclostrobin + boscalid provided a high control of both GTD fungi while Trichoderma-based treatments showed a low efficacy. The poor performance and implantation of treatments based on Trichoderma spp. it is further discussed considering among other factors, the high spore load of GTD fungi used in the artificial inoculations, the short period elapsed between the BCAs treatments application and artificial inoculation with GTD fungi, the effect of unfavourable environmental conditions for the implantation of Trichoderma or the possibility of a low affinity of these fungi for the cultivar 'Godello'.

[Resumen] Las enfermedades de la madera de la vid (EMV) se encuentran entre las principales amenazas bióticas para la sostenibilidad económica de la industria vitivinícola mundial, reduciendo el rendimiento, productividad y longevidad de los viñedos. Varios factores han sido atribuidos al aumento de su incidencia en los últimos años, como son los cambios en las prácticas culturales de los viñedos, la baja calidad sanitaria del material de propagación de vid, la prohibición de las materias activas químicas más efectivas y la deficiente protección de las heridas de poda. Además, estas enfermedades son muy complejas, implicando un amplio espectro de hongos no relacionados taxonómicamente, lo que hace que su control sea muy difícil. En esta tesis, se realizaron estudios para la puesta a punto de nuevas técnicas moleculares para la mejora en la detección y gestión de las EMV, así como, la evaluación de alternativas sostenibles al uso de fungicidas que permitan aumentar la vida útil de los viñedos. En primer lugar, se evaluó comparativamente la precisión, la eficiencia y la especificidad de las técnicas de PCR digital (ddPCR) y PCR en tiempo real (qPCR) para la detección y cuantificación de Ilyonectria liriodendri a partir de muestras de suelo, rizosfera y endorizosfera de viñedos jóvenes y aparentemente sanos de La Rioja. Los resultados revelaron una fuerte correlación entre ambas técnicas, siendo la ddPCR más sensible a concentraciones muy bajas del patógeno. Se observó que las raíces de vides asintomáticas son un nicho microbiano que está habitado por patógenos asociados a la enfermedad del pie negro. A continuación, se caracterizó la dinámica espacial de las comunidades fúngicas de estos tres compartimentos, mediante la técnica de secuenciación masiva de amplicones (HTAS), observándose que las comunidades de hongos fueron homogéneas entre viñedos. Teniendo en cuenta que los estudios se realizaron en viñedos con variables climáticas y edáficas similares, estos resultados indican que el microbioma del viñedo de La Rioja se conserva parcialmente en la región. Sin embargo, el compartimento suelo-planta constituyó la principal fuente de diversidad y composición de las comunidades fúngicas, con una disminución de la diversidad en la endorizosfera, sugiriendo que los tejidos de la raíz suponen una barrera para la colonización fúngica. El análisis predictivo de funcionalidad mostró un aumento en la abundancia relativa de posibles patógenos de plantas, endófitos y micorrizas arbusculares, y una disminución en la abundancia relativa de posibles saprótrofos de la madera y/o estiércol, del suelo hacia la endorizosfera. Se

corrobora así mismo que los tejidos internos de la raíz de las vides asintomáticas son un nicho microbiano que está habitado por hongos asociados a las EMV. La HTAS también se empleó para determinar el efecto de la época de poda en la diversidad y composición del microbioma fúngico que coloniza las heridas de poda de forma natural durante dos períodos de infección (noviembre-febrero y febrero-mayo), en viñedos pertenecientes a tres Denominaciones de Origen (D.O.) de Galicia (España). Las comunidades fúngicas que colonizan las heridas de poda de la vid se vieron afectadas en su composición y diversidad por la D.O., mientras que la variación espacial dentro de cada región fue baja. Se constató la existencia de un microbioma fúngico estable en las heridas de poda, independientemente del período de infección, con abundancias más altas para la mayoría de los géneros de hongos asociados a EMV después de la poda de febrero (invierno) que en la de noviembre (mediados de otoño), lo que sugiere un efecto estacional en las infecciones de las heridas de poda. Además, se observó una correlación positiva entre la lluvia acumulada y la abundancia del microbioma fúngico total, y del género Diaporthe en particular, durante la octava y la undécima semana después de la poda. Una de las alternativas al uso de fungicidas en el control de las EMV es la utilización de cultivares menos sensibles a estos patógenos. En este sentido se evaluó, en un ensayo bajo condiciones de invernadero, la tolerancia de cultivares de vid comerciales y minoritarios, presentes en colecciones de germoplasma españolas, ante la infección de Phaeomoniella chlamydospora, el principal agente causal de la enfermedad de Petri y la yesca. No se observaron síntomas foliares en las plantas, si bien todos los cultivares desarrollaron lesiones internas en la madera después de la inoculación artificial con el hongo, lo que indica que no hay evidencia de que exista resistencia cualitativa a Pa. chlamydospora. Sin embargo, la severidad de los síntomas internos de la madera varió considerablemente entre los cultivares, lo que permitió clasificarlos en base a diversos grados de tolerancia parcial a la infección fúngica. Los cultivares ‘Estaldiña’, ‘Albillo Mayor’ y ‘Castañal’ se clasificaron como los más tolerantes en función de las longitudes medias de necrosis de la madera. En relación con las estrategias de manejo de estas enfermedades, se evaluó el efecto de varios agentes de control biológico (ACBs), aplicados como tratamientos radiculares en pre- y post-plantación, para controlar infecciones naturales causadas por hongos asociados con las enfermedades del pie negro y de Petri, así como, su influencia en los parámetros de crecimiento de la planta. La efectividad del ACB para reducir la incidencia y la severidad de ambas enfermedades varió con la edad y la parte de la planta analizada.

Bajo escenarios específicos, Streptomyces sp. E1 + R4 redujo significativamente las infecciones causadas por Dactylonectria torresensis y D. macrodidyma (pie negro), mientras que Pythium oligandrum Po37 y Trichoderma spp. redujeron significativamente las infecciones causadas por Pa. chlamydospora y Phaeoacremonium minimum (enfermedad de Petri). Los tratamientos con ACB redujeron significativamente el peso de la raíz con respecto al control, mientras que no se observó ningún efecto sobre el peso del brote. Finalmente, se evaluó la eficacia de diversas formulaciones fungicidas y de ACB, registradas en España, como protectores de heridas de poda frente a infecciones artificiales de Diplodia seriata y Pa. chlamydospora, en dos viñedos de la D.O. Valdeorras (Galicia, España). Los resultados mostraron, en estas condiciones de estudio, que los tratamientos basados en ACBs fueron menos efectivos que los fungicidas. La formulación comercial basada en piraclostrobin + boscalida proporcionó un alto control de ambos hongos asociados a las EMV, mientras que los tratamientos basados en Trichoderma mostraron baja eficacia. El bajo rendimiento e implantación de los tratamientos basados en Trichoderma spp. es discutido más a fondo, valorando entre otros factores, la elevada carga de esporas utilizada en las inoculaciones artificiales de los hongos asociados con las EMV, el corto periodo de tiempo transcurrido entre la aplicación del ACB y la inoculación artificial de los mismos, el efecto de las condiciones ambientales adversas para la implantación de Trichoderma o la posibilidad de una baja afinidad de estos hongos por el cultivar ‘Godello’.

[Resumo] As enfermidades da madeira da vide (EMV) atópanse entre as principais ameazas bióticas para a sustentabilidade económica da industria vitivinícola mundial, reducindo o rendemento, produtividade e lonxevidade dos viñedos. Varios factores foron atribuídos ao aumento da súa incidencia nos últimos anos, como son os cambios nas prácticas culturais dos viñedos, a baixa calidade sanitaria do material de propagación de vide, a prohibición das materias activas químicas máis efectivas e a deficiente protección das feridas de poda. Ademais, estas enfermidades son moi complexas, implicando un amplo espectro de fungos non relacionados taxonómicamente, o que fai que o seu control sexa moi difícil. Nesta tese, realizáronse estudos para a posta a punto de novas técnicas moleculares para a mellora na detección e xestión das EMV, así como, a avaliación de alternativas sostibles ao emprego de funxicidas que permitan aumentar a vida útil dos viñedos. En primeiro lugar, avaliouse comparativamente a precisión, a eficiencia e a especificidade das técnicas de PCR dixital (ddPCR) e PCR en tempo real (qPCR) para a detección e cuantificación de Ilyonectria liriodendri en mostras de solo, rizosfera e endorizosfera de viñedos novos e aparentemente sans de La Rioja. Os resultados revelaron unha forte correlación entre ambas as técnicas, sendo a ddPCR máis sensible a concentracións moi baixas do patóxeno. Observouse que as raíces de vides asintomáticas son un nicho microbiano que está habitado por patóxenos asociados á enfermidade do pé negro. A continuación, caracterizouse a dinámica espacial das comunidades fúnxicas destes tres compartimentos mediante a técnica de secuenciación masiva de amplicóns (HTAS), observándose que as comunidades de fungos foron homoxéneas entre viñedos. Tendo en conta que os estudos se realizaron en viñedos con variables climáticas e edáficas similares, estes resultados indican que o microbioma do viñedo de La Rioja consérvase parcialmente na rexión. Porén, o compartimento solo-planta constituíu a principal fonte de diversidade e composición das comunidades fúnxicas, cunha diminución da diversidade na endorizosfera, suxerindo que os tecidos da raíz supoñen unha barreira para a colonización fúnxica. A análise preditiva de funcionalidade mostrou un aumento na abundancia relativa de posibles patóxenos de plantas, endófitos e micorrizas arbusculares, e unha diminución na abundancia relativa de posibles saprótrofos da madeira e/ou do esterco, do solo cara a

endorizosfera. Corrobórase así mesmo que os tecidos internos da raíz das vides asintomáticas son un nicho microbiano que está habitado por fungos asociados ás EMV. A HTAS empregouse tamén para determinar o efecto da época de poda na diversidade e composición do microbioma fúnxico que coloniza as feridas de poda de forma natural durante dous períodos de infección (novembro-febreiro e febreiro-maio), en viñedos pertencentes a tres Denominacións de Orixe (D.O.) de Galicia (España). As comunidades fúnxicas que colonizan as feridas de poda da vide víronse afectadas na súa composición e diversidade pola D.O., mentres que a variación espacial dentro de cada rexión foi baixa. Constatouse a existencia dun microbioma fúnxico estable nas feridas de poda, independentemente do período de infección, con abundancias máis altas para a maioría dos xéneros de fungos asociados ás EMV despois da poda de febreiro (inverno) que na de novembro (mediados de outono), o que suxire un efecto estacional nas infeccións das feridas de poda. Ademais, observouse unha correlación positiva entre a chuvia acumulada e a abundancia do microbioma fúnxico total, e do xénero Diaporthe en particular, durante a oitava e a undécima semana despois da poda. Unha das alternativas ao emprego de funxicidas no control das EMV é a utilización de cultivares menos sensibles a estes patóxenos. Neste sentido avaliouse, nun ensaio baixo condicións de invernadoiro, a tolerancia de cultivares de vide comerciais e minoritarios presentes en coleccións de xermoplasma españolas, ante a infección de Phaeomoniella chlamydospora, principal axente causal da enfermidade de Petri e da iesca. Non se observaron síntomas foliares nas plantas, se ben todos os cultivares desenvolveron lesións internas na madeira despois da inoculación artificial co fungo, o que indica que non hai evidencia de que exista resistencia cualitativa a Pa. chlamydospora. Porén, a severidade dos síntomas internos da madeira variou considerablemente entre os cultivares, o que permitiu clasificalos en base a diversos grados de tolerancia parcial á infección fúnxica. Os cultivares ‘Estaldiña’, ‘Albillo Mayor’ e ‘Castañal’ clasificáronse como os máis tolerantes en función das lonxitudes medias de necrose da madeira. En relación coas estratexias de manexo destas enfermidades, avaliouse o efecto de varios axentes de control biolóxico (ACBs), aplicados como tratamentos radiculares en pre- e post-plantación para controlar infeccións naturais causadas por fungos asociados coas enfermidades do pé negro e de Petri, así como, a súa influencia nos parámetros de crecemento da planta. A efectividade do ACB para reducir a incidencia e a severidade de ambas enfermidades variou coa idade e a parte da planta analizada. Baixo escenarios específicos, Streptomyces sp. E1 + R4 reduciu significativamente as infeccións causadas por

Dactylonectria torresensis e D. macrodidyma (pé negro), mentres que Pythium oligandrum Po37 e Trichoderma spp. reduciron significativamente as infeccións causadas por Pa. chlamydospora e Phaeoacremonium minimum (enfermidade de Petri). Os tratamentos con ACB reduciron significativamente o peso da raíz con respecto ao control, mentres que non se observou ningún efecto sobre o peso do brote. Finalmente, avaliouse a eficacia de diversas formulacións funxicidas e de ACB, rexistradas en España, como protectores das feridas de poda fronte a infeccións artificiais de Diplodia seriata e Pa. chlamydospora, en dous viñedos da D.O. Valdeorras (Galicia). Os resultados amosaron, nestas condicións de estudo, que os tratamentos baseados en ACBs foron menos efectivos que os funxicidas. A formulación comercial baseada en piraclostrobin + boscalida proporcionou un alto control de ambos os fungos asociados ás EMV, mentres que os tratamentos baseados en Trichoderma mostraron baixa eficacia. O baixo rendemento e implantación dos tratamentos baseados en Trichoderma spp. discútese máis a fondo, valorando entre outros factores, a elevada carga de esporas empregada nas inoculacións artificiais dos fungos asociados coas EMV, o corto período de tempo transcorrido entre a aplicación do ACB e a inoculación artificial dos mesmos, o efecto das condicións ambientais adversas para a implantación de Trichoderma ou a posibilidade dunha baixa afinidade destes fungos polo cultivar ‘Godello’.