Advances Towards Integrated Management of Fungal Grapevine Trunk Diseases
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- Teses de doutoramento [2147]
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Advances Towards Integrated Management of Fungal Grapevine Trunk DiseasesAuthor(s)
Directors
Gramaje, DavidDíaz Losada, Emilia
Date
2020Abstract
[Abstract]
Grapevine trunk diseases (GTDs) are among the main biotic threats to the economic
sustainability of the grapevine industry worldwide, reducing yields, productivity and
longevity of vineyards. Several factors such as changes in vineyard cultural practices, low
sanitary quality of the grapevine propagation material, the ban of most effective chemical
active ingredients, and poor protection of pruning wounds have increased their incidence
over last years. Moreover, these diseases are very complex and involve a broad spectrum
of taxonomically unrelated fungi making their control very challenging. In this thesis, the
development and implementation of novel molecular techniques that lead to the
improvement of practical effective strategies to the GTD management were investigated.
The assessment of sustainable alternatives to the use of fungicides to increase vineyards
lifespan was also performed.
Initially, we comparatively assessed the accuracy, efficiency, and specificity of Droplet
Digital PCR (ddPCR) and real-time PCR (qPCR) techniques for the detection and
quantification of Ilyonectria liriodendri in bulk and rhizosphere soil, as well as, grapevine
endorhizosphere obtained from healthy young vines in La Rioja region. The results
revealed a strong correlation between both techniques with ddPCR being more sensitive
to very low pathogen concentrations. Roots of asymptomatic vines were found to be a
microbial niche that is inhabited by black-foot disease pathogens.
Then, the spatial dynamics of the fungal communities of these three soil-plant
compartments were also characterized by high-throughput amplicon sequencing (HTAS).
Soil fungal assemblages had extensive local homogeneity across small distances, and soils
with similar climatic and edaphic variables, thus suggesting that vineyard fungal
communities are partially conserved in La Rioja region. The diversity and composition of
the fungal communities were largely affected by the soil-plant compartment, with
diversity decreasing in the endorhizosphere and suggesting that the root tissues entail a
barrier for fungal colonization. The results of functional prediction suggested an increase
in the relative abundances of potential plant pathogens, endophytes and arbuscular
mycorrhiza, and a decrease in the relative abundance of potential wood and/or dung
saprotrophs were predicted from bulk soil towards the endorhizosphere. Once more, it
was found that the internal root tissues of asymptomatic vines are a microbial niche that
is inhabited by GTD fungi.
Abstract
xiv
The HTAS technique was also used to determine the effect of pruning time on the
fungal microbiome diversity and composition that colonized pruning wounds naturally
over two infection periods (November-February and February-May), in vineyards
belonging to three Denominations of Origin (D.O.) in Galicia (Spain). The fungal
communities colonizing grapevine pruning wounds were affected in their composition
and diversity by the D.O., whereas the spatial variation within each region was low. The
results showed the existence of a core community of fungal species conserved in grapevine
pruned canes regardless of the infection period. Higher abundances for most GTD genera
were detected after pruning in February (winter) than in November (mid-autumn),
therefore suggesting a seasonal effect on pruning wounds infections. Additionally, a
positive correlation was observed between the accumulated rainfall and the abundance of
the total fungal microbiome and Diaporthe genus over eighth and eleventh weeks after
pruning.
Planting tolerant grapevine cultivars is one of the alternatives to the use of fungicides
in controlling GTDs. The tolerance to Phaeomoniella chlamydospora infection of
commercial and minority grapevine cultivars from Spanish germplasm collections was
evaluated in a rapid and effective detached cutting assay under greenhouse conditions. All
cultivars developed internal wood lesions after artificial inoculation with the causal agent
of Petri disease and esca, indicating that there is no evidence of qualitative resistance to
this fungus. Nevertheless, the severity of internal wood symptoms varied considerably
amongst cultivars allowing to classify them according to varying signs of partial tolerance
to Pa. chlamydospora. The cultivars ‘Estaldiña’, ‘Albillo Mayor’ or ‘Castañal’ were classified
as the most tolerant based on mean lengths of wood discolouration. No foliar symptoms
were observed on artificially inoculated plants during the experiments.
Regarding disease management strategies, we assessed the effect of several biocontrol
agents (BCAs) applied as root treatments at pre- and post-planting to control natural
infections caused by black-foot and Petri diseases fungi, and their influence in plant
growth parameters. Results showed that BCA effectiveness was dependent on the plant
age and the plant part analyzed in reducing the incidence and severity of both diseases.
Under specific scenarios, Streptomyces sp. E1 + R4 significantly reduced Dactylonectria
torresensis and D. macrodidyma (black-foot) infections, while Pythium oligandrum Po37
and Trichoderma spp. significantly reduced Pa. chlamydospora and Phaeoacremonium
minimum (Petri disease) infections. BCAs treatments significantly reduced root weight
with respect to the control while no effect was observed on the shoot weight.
Abstract
xv
Finally, we comparatively evaluated the efficacy of various fungicide and BCA
formulations registered in Spain to act as pruning wound protectants against Diplodia
seriata and Pa. chlamydospora, in the two vineyards of the D.O. Valdeorras (Galicia,
Spain). Results showed that BCA-based treatments were less effective than fungicides. The
commercial formulation containing pyraclostrobin + boscalid provided a high control of
both GTD fungi while Trichoderma-based treatments showed a low efficacy. The poor
performance and implantation of treatments based on Trichoderma spp. it is further
discussed considering among other factors, the high spore load of GTD fungi used in the
artificial inoculations, the short period elapsed between the BCAs treatments application
and artificial inoculation with GTD fungi, the effect of unfavourable environmental
conditions for the implantation of Trichoderma or the possibility of a low affinity of these fungi for the cultivar 'Godello'. [Resumen]
Las enfermedades de la madera de la vid (EMV) se encuentran entre las principales
amenazas bióticas para la sostenibilidad económica de la industria vitivinícola mundial,
reduciendo el rendimiento, productividad y longevidad de los viñedos. Varios factores han
sido atribuidos al aumento de su incidencia en los últimos años, como son los cambios en
las prácticas culturales de los viñedos, la baja calidad sanitaria del material de propagación
de vid, la prohibición de las materias activas químicas más efectivas y la deficiente
protección de las heridas de poda. Además, estas enfermedades son muy complejas,
implicando un amplio espectro de hongos no relacionados taxonómicamente, lo que hace
que su control sea muy difícil. En esta tesis, se realizaron estudios para la puesta a punto
de nuevas técnicas moleculares para la mejora en la detección y gestión de las EMV, así
como, la evaluación de alternativas sostenibles al uso de fungicidas que permitan
aumentar la vida útil de los viñedos.
En primer lugar, se evaluó comparativamente la precisión, la eficiencia y la
especificidad de las técnicas de PCR digital (ddPCR) y PCR en tiempo real (qPCR) para la
detección y cuantificación de Ilyonectria liriodendri a partir de muestras de suelo, rizosfera
y endorizosfera de viñedos jóvenes y aparentemente sanos de La Rioja. Los resultados
revelaron una fuerte correlación entre ambas técnicas, siendo la ddPCR más sensible a
concentraciones muy bajas del patógeno. Se observó que las raíces de vides asintomáticas
son un nicho microbiano que está habitado por patógenos asociados a la enfermedad del
pie negro.
A continuación, se caracterizó la dinámica espacial de las comunidades fúngicas de
estos tres compartimentos, mediante la técnica de secuenciación masiva de amplicones
(HTAS), observándose que las comunidades de hongos fueron homogéneas entre viñedos.
Teniendo en cuenta que los estudios se realizaron en viñedos con variables climáticas y
edáficas similares, estos resultados indican que el microbioma del viñedo de La Rioja se
conserva parcialmente en la región. Sin embargo, el compartimento suelo-planta
constituyó la principal fuente de diversidad y composición de las comunidades fúngicas,
con una disminución de la diversidad en la endorizosfera, sugiriendo que los tejidos de la
raíz suponen una barrera para la colonización fúngica. El análisis predictivo de
funcionalidad mostró un aumento en la abundancia relativa de posibles patógenos de
plantas, endófitos y micorrizas arbusculares, y una disminución en la abundancia relativa
de posibles saprótrofos de la madera y/o estiércol, del suelo hacia la endorizosfera. Se
corrobora así mismo que los tejidos internos de la raíz de las vides asintomáticas son un
nicho microbiano que está habitado por hongos asociados a las EMV.
La HTAS también se empleó para determinar el efecto de la época de poda en la
diversidad y composición del microbioma fúngico que coloniza las heridas de poda de
forma natural durante dos períodos de infección (noviembre-febrero y febrero-mayo), en
viñedos pertenecientes a tres Denominaciones de Origen (D.O.) de Galicia (España). Las
comunidades fúngicas que colonizan las heridas de poda de la vid se vieron afectadas en
su composición y diversidad por la D.O., mientras que la variación espacial dentro de cada
región fue baja. Se constató la existencia de un microbioma fúngico estable en las heridas
de poda, independientemente del período de infección, con abundancias más altas para la
mayoría de los géneros de hongos asociados a EMV después de la poda de febrero
(invierno) que en la de noviembre (mediados de otoño), lo que sugiere un efecto estacional
en las infecciones de las heridas de poda. Además, se observó una correlación positiva
entre la lluvia acumulada y la abundancia del microbioma fúngico total, y del género
Diaporthe en particular, durante la octava y la undécima semana después de la poda.
Una de las alternativas al uso de fungicidas en el control de las EMV es la utilización de
cultivares menos sensibles a estos patógenos. En este sentido se evaluó, en un ensayo bajo
condiciones de invernadero, la tolerancia de cultivares de vid comerciales y minoritarios,
presentes en colecciones de germoplasma españolas, ante la infección de Phaeomoniella
chlamydospora, el principal agente causal de la enfermedad de Petri y la yesca. No se
observaron síntomas foliares en las plantas, si bien todos los cultivares desarrollaron
lesiones internas en la madera después de la inoculación artificial con el hongo, lo que
indica que no hay evidencia de que exista resistencia cualitativa a Pa. chlamydospora. Sin
embargo, la severidad de los síntomas internos de la madera varió considerablemente
entre los cultivares, lo que permitió clasificarlos en base a diversos grados de tolerancia
parcial a la infección fúngica. Los cultivares ‘Estaldiña’, ‘Albillo Mayor’ y ‘Castañal’ se
clasificaron como los más tolerantes en función de las longitudes medias de necrosis de la
madera.
En relación con las estrategias de manejo de estas enfermedades, se evaluó el efecto de
varios agentes de control biológico (ACBs), aplicados como tratamientos radiculares en
pre- y post-plantación, para controlar infecciones naturales causadas por hongos
asociados con las enfermedades del pie negro y de Petri, así como, su influencia en los
parámetros de crecimiento de la planta. La efectividad del ACB para reducir la incidencia
y la severidad de ambas enfermedades varió con la edad y la parte de la planta analizada.
Bajo escenarios específicos, Streptomyces sp. E1 + R4 redujo significativamente las
infecciones causadas por Dactylonectria torresensis y D. macrodidyma (pie negro),
mientras que Pythium oligandrum Po37 y Trichoderma spp. redujeron significativamente
las infecciones causadas por Pa. chlamydospora y Phaeoacremonium minimum
(enfermedad de Petri). Los tratamientos con ACB redujeron significativamente el peso de
la raíz con respecto al control, mientras que no se observó ningún efecto sobre el peso del
brote.
Finalmente, se evaluó la eficacia de diversas formulaciones fungicidas y de ACB,
registradas en España, como protectores de heridas de poda frente a infecciones artificiales
de Diplodia seriata y Pa. chlamydospora, en dos viñedos de la D.O. Valdeorras (Galicia,
España). Los resultados mostraron, en estas condiciones de estudio, que los tratamientos
basados en ACBs fueron menos efectivos que los fungicidas. La formulación comercial
basada en piraclostrobin + boscalida proporcionó un alto control de ambos hongos
asociados a las EMV, mientras que los tratamientos basados en Trichoderma mostraron
baja eficacia. El bajo rendimiento e implantación de los tratamientos basados en
Trichoderma spp. es discutido más a fondo, valorando entre otros factores, la elevada carga
de esporas utilizada en las inoculaciones artificiales de los hongos asociados con las EMV,
el corto periodo de tiempo transcurrido entre la aplicación del ACB y la inoculación
artificial de los mismos, el efecto de las condiciones ambientales adversas para la
implantación de Trichoderma o la posibilidad de una baja afinidad de estos hongos por el cultivar ‘Godello’. [Resumo]
As enfermidades da madeira da vide (EMV) atópanse entre as principais ameazas
bióticas para a sustentabilidade económica da industria vitivinícola mundial, reducindo o
rendemento, produtividade e lonxevidade dos viñedos. Varios factores foron atribuídos ao
aumento da súa incidencia nos últimos anos, como son os cambios nas prácticas culturais
dos viñedos, a baixa calidade sanitaria do material de propagación de vide, a prohibición
das materias activas químicas máis efectivas e a deficiente protección das feridas de poda.
Ademais, estas enfermidades son moi complexas, implicando un amplo espectro de fungos
non relacionados taxonómicamente, o que fai que o seu control sexa moi difícil. Nesta
tese, realizáronse estudos para a posta a punto de novas técnicas moleculares para a
mellora na detección e xestión das EMV, así como, a avaliación de alternativas sostibles ao
emprego de funxicidas que permitan aumentar a vida útil dos viñedos.
En primeiro lugar, avaliouse comparativamente a precisión, a eficiencia e a
especificidade das técnicas de PCR dixital (ddPCR) e PCR en tempo real (qPCR) para a
detección e cuantificación de Ilyonectria liriodendri en mostras de solo, rizosfera e
endorizosfera de viñedos novos e aparentemente sans de La Rioja. Os resultados revelaron
unha forte correlación entre ambas as técnicas, sendo a ddPCR máis sensible a
concentracións moi baixas do patóxeno. Observouse que as raíces de vides asintomáticas
son un nicho microbiano que está habitado por patóxenos asociados á enfermidade do pé
negro.
A continuación, caracterizouse a dinámica espacial das comunidades fúnxicas destes
tres compartimentos mediante a técnica de secuenciación masiva de amplicóns (HTAS),
observándose que as comunidades de fungos foron homoxéneas entre viñedos. Tendo en
conta que os estudos se realizaron en viñedos con variables climáticas e edáficas similares,
estes resultados indican que o microbioma do viñedo de La Rioja consérvase parcialmente
na rexión. Porén, o compartimento solo-planta constituíu a principal fonte de diversidade
e composición das comunidades fúnxicas, cunha diminución da diversidade na
endorizosfera, suxerindo que os tecidos da raíz supoñen unha barreira para a colonización
fúnxica. A análise preditiva de funcionalidade mostrou un aumento na abundancia relativa
de posibles patóxenos de plantas, endófitos e micorrizas arbusculares, e unha diminución
na abundancia relativa de posibles saprótrofos da madeira e/ou do esterco, do solo cara a
endorizosfera. Corrobórase así mesmo que os tecidos internos da raíz das vides
asintomáticas son un nicho microbiano que está habitado por fungos asociados ás EMV.
A HTAS empregouse tamén para determinar o efecto da época de poda na diversidade
e composición do microbioma fúnxico que coloniza as feridas de poda de forma natural
durante dous períodos de infección (novembro-febreiro e febreiro-maio), en viñedos
pertencentes a tres Denominacións de Orixe (D.O.) de Galicia (España). As comunidades
fúnxicas que colonizan as feridas de poda da vide víronse afectadas na súa composición e
diversidade pola D.O., mentres que a variación espacial dentro de cada rexión foi baixa.
Constatouse a existencia dun microbioma fúnxico estable nas feridas de poda,
independentemente do período de infección, con abundancias máis altas para a maioría
dos xéneros de fungos asociados ás EMV despois da poda de febreiro (inverno) que na de
novembro (mediados de outono), o que suxire un efecto estacional nas infeccións das
feridas de poda. Ademais, observouse unha correlación positiva entre a chuvia acumulada
e a abundancia do microbioma fúnxico total, e do xénero Diaporthe en particular, durante
a oitava e a undécima semana despois da poda.
Unha das alternativas ao emprego de funxicidas no control das EMV é a utilización de
cultivares menos sensibles a estes patóxenos. Neste sentido avaliouse, nun ensaio baixo
condicións de invernadoiro, a tolerancia de cultivares de vide comerciais e minoritarios
presentes en coleccións de xermoplasma españolas, ante a infección de Phaeomoniella
chlamydospora, principal axente causal da enfermidade de Petri e da iesca. Non se
observaron síntomas foliares nas plantas, se ben todos os cultivares desenvolveron lesións
internas na madeira despois da inoculación artificial co fungo, o que indica que non hai
evidencia de que exista resistencia cualitativa a Pa. chlamydospora. Porén, a severidade
dos síntomas internos da madeira variou considerablemente entre os cultivares, o que
permitiu clasificalos en base a diversos grados de tolerancia parcial á infección fúnxica. Os
cultivares ‘Estaldiña’, ‘Albillo Mayor’ e ‘Castañal’ clasificáronse como os máis tolerantes en
función das lonxitudes medias de necrose da madeira.
En relación coas estratexias de manexo destas enfermidades, avaliouse o efecto de
varios axentes de control biolóxico (ACBs), aplicados como tratamentos radiculares en
pre- e post-plantación para controlar infeccións naturais causadas por fungos asociados
coas enfermidades do pé negro e de Petri, así como, a súa influencia nos parámetros de
crecemento da planta. A efectividade do ACB para reducir a incidencia e a severidade de
ambas enfermidades variou coa idade e a parte da planta analizada. Baixo escenarios
específicos, Streptomyces sp. E1 + R4 reduciu significativamente as infeccións causadas por
Dactylonectria torresensis e D. macrodidyma (pé negro), mentres que Pythium oligandrum
Po37 e Trichoderma spp. reduciron significativamente as infeccións causadas por Pa.
chlamydospora e Phaeoacremonium minimum (enfermidade de Petri). Os tratamentos con
ACB reduciron significativamente o peso da raíz con respecto ao control, mentres que non
se observou ningún efecto sobre o peso do brote.
Finalmente, avaliouse a eficacia de diversas formulacións funxicidas e de ACB,
rexistradas en España, como protectores das feridas de poda fronte a infeccións artificiais
de Diplodia seriata e Pa. chlamydospora, en dous viñedos da D.O. Valdeorras (Galicia). Os
resultados amosaron, nestas condicións de estudo, que os tratamentos baseados en ACBs
foron menos efectivos que os funxicidas. A formulación comercial baseada en
piraclostrobin + boscalida proporcionou un alto control de ambos os fungos asociados ás
EMV, mentres que os tratamentos baseados en Trichoderma mostraron baixa eficacia. O
baixo rendemento e implantación dos tratamentos baseados en Trichoderma spp.
discútese máis a fondo, valorando entre outros factores, a elevada carga de esporas
empregada nas inoculacións artificiais dos fungos asociados coas EMV, o corto período de
tempo transcorrido entre a aplicación do ACB e a inoculación artificial dos mesmos, o
efecto das condicións ambientais adversas para a implantación de Trichoderma ou a posibilidade dunha baixa afinidade destes fungos polo cultivar ‘Godello’.
Keywords
Hongos en la agricultura
Viña-Enfermedades y plagas
Viticultura
Enemigos de los cultivos-Lucha biológica contra
Viña-Enfermedades y plagas
Viticultura
Enemigos de los cultivos-Lucha biológica contra
Description
Programa Oficial de Doutoramento en Biotecnoloxía Avanzada. 5012V01
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