Biomarker search in rheumatic diseases through conventional and emerging proteomic technologies

Abstract

[Abstract] There are more than 200 rheumatic diseases, which are the second leading cause of incapacitation worldwide and affect about 2 billion people, mainly women. This thesis focuses especially on two of the most common: osteoarthritis (OA) and rheumatoid arthritis (RA). Despite the differences between them, they all produce similar symptoms (joint pain, stiffness and even loss of functionality), although their current diagnosis and treatment are limited. The standard diagnosis includes the use of imaging techniques, which can be harmful to the patient, and the analysis of non-specific markers. OA treatment is aimed at alleviating pain and improving the functionality of the joints, although joint replacement may be even necessary at the last stages of the disease; while RA treatment includes various therapeutic strategies through trial-error. Due to these limitations in diagnosis and treatment, there is a great need to find biomarkers that facilitate the understanding of the pathological processes that take place, in order to better specify the diagnosis and effective treatment for the management of these diseases. Particularly, in this thesis, different proteomic studies based on mass spectrometry (MS) and immunoassays have been carried out, with the aim of finding proteins with potential biomarker value in RA and OA, which could facilitate classification, diagnosis and subsequent selection of effective therapies. In the first study, the search for a biomarker protein panel has been carried out for monitoring disease activity in RA patients, one of the major limitations for the corresponding selection of effective and specific therapies that could help to remit the characteristic acute episodes of this pathology. Initially, a panel of 11 candidate proteins has been identified by MS and relative quantification with iTRAQ labeling in depleted plasma pools of RA patients with extreme disease activities. In order to confirm the trend of these 11 proteins, 80 individual plasma samples of RA patients with different disease activities have been analyzed by targeted MS, with the aid of standard labeled peptides, of which 5 have been verified as potential biomarkers. Finally, 4 of them (SAA1, AACT, HPT and A1AG1) have been validated by ELISA in 420 plasma samples from patients with RA, healthy donors and controls of other analogous diseases. Hence, this validated panel could be useful for the diagnosis of autoimmune inflammatory rheumatic diseases such as RA and disease activity monitoring, crucial for proper follow-up and treatment. In the second and third studies, two different types of more emerging proteomic techniques have been carried out in order to find biomarkers in OA. On the one hand, two independent peptide studies have been carried out by means of MS in cartilage secretomes and synovial fluid and serum samples from OA patients and healthy donors. Peptidomics can be of great interest in OA, since the deterioration of cartilage is linked to various processes, among which, the action of proteases that produce neopeptides with possible biomarker role for OA diagnosis or monitoring stands out. Thus, 8 PRELP, CLUS, CILP1, COMP and MGP neopeptides were significantly altered in cartilage secretomes of OA patients, whose release seems to be also dependent on the affected joint. In addition, 6 neopeptides belonging to APOA4, ITIH4, CO3 and KNG1 have been altered in serum pools of OA patients and healthy donors, although no confirmatory statistical analysis has been performed yet. On the other hand, two hybrid immunoaffinity-based techniques coupled to mass spectrometry (IA-MS) have been developed for the detection of two specific cartilage proteins (CILP1 and PRG4) in serum samples. An immuno-MALDI (iMALDI) assay for the detection of PRG4 and another of SISCAPA-MRM for the analysis of CILP1 have been developed. Although the tendency of these proteins is to be increased in OA patients versus healthy controls, this alteration has not become significant yet in the analyzed small cohort of serum samples.

[Resumen] Existen más de 200 enfermedades reumáticas, las cuales son la segunda causa de incapacitación a nivel mundial y afectan a cerca de 2 billones de personas, fundamentalmente a mujeres. Esta tesis se centra especialmente en dos de las más comunes: artrosis (OA) y artritis reumatoide (RA). A pesar de las diferencias que existen entre ellas, todas producen síntomas similares (dolor, rigidez y pérdida de funcionalidad articular), aunque sus actuales diagnósticos y tratamientos son limitados. El diagnóstico habitual incluye el uso de técnicas de imagen, las cuales pueden resultar dañinas para el paciente, y el análisis de marcadores no-específicos. El tratamiento de la OA está dirigido a paliar el dolor y mejorar la funcionalidad de las articulaciones, llegando incluso a ser necesario el reemplazo articular; mientras que el de la RA incluye diversas estrategias terapéuticas mediante ensayo-error. Debido a estas limitaciones, hay una gran necesidad de encontrar biomarcadores que faciliten el entendimiento de los procesos patológicos que tienen lugar con el fin de definir mejor el diagnóstico y tratamiento efectivos para el manejo de estas enfermedades. Particularmente, en esta tesis, se han realizado diferentes estudios proteómicos basados en espectrometría de masas (MS) e inmunoensayos, con el fin de encontrar proteínas con potencial papel biomarcador en RA y OA y así facilitar su clasificación, diagnóstico y posterior selección de terapias efectivas. En el primer estudio, se ha llevado a cabo la búsqueda de un panel de proteínas biomarcadoras para monitorizar la actividad de la enfermedad en pacientes con RA, una de las mayores limitaciones para la adecuada selección de terapias efectivas y específicas que ayuden a remitir los episodios agudos característicos de esta patología. Inicialmente, se ha identificado mediante MS y cuantificación relativa con marcaje iTRAQ, un panel de 11 proteínas candidatas en muestras de plasma agrupadas y deplecionadas de pacientes RA con actividades de enfermedad extremas. Con objeto de confirmar la tendencia de estas 11 proteínas, 80 muestras de plasma individuales de pacientes RA con diferentes actividades de enfermedad han sido analizadas mediante MS dirigida, con ayuda de péptidos estándar marcados, de las cuales 5 han sido verificadas como potenciales biomarcadores. Finalmente, 4 de ellas (SAA1, AACT, HPT y A1AG1) han sido validadas mediante ELISA en 420 muestras de plasma de pacientes con RA, donantes sanos y controles de otras enfermedades análogas. Así, este panel validado podría ser útil para el diagnóstico de enfermedades reumáticas inflamatorias autoinmunes como la RA y la monitorización de actividad de enfermedad, crucial para el adecuado seguimiento y tratamiento. En el segundo y tercer estudios, se han llevado a cabo dos tipos diferentes de técnicas proteómicas más emergentes con el fin de encontrar biomarcadores en OA. Por un lado, se han realizado dos estudios peptidómicos independientes mediante MS en secretomas de cartílago y en muestras de líquido sinovial y suero de pacientes OA y donantes sanos. La peptidómica puede ser de gran interés en la OA, ya que el deterioro del cartílago está ligado a diversos procesos, entre los que destaca la acción de las proteasas que producen neopéptidos con posible papel biomarcador de diagnóstico o monitorización de la OA. Así, 8 neopéptidos de PRELP, CLUS, CILP1, COMP y MGP se vieron significativamente alterados en secretomas de cartílago de pacientes OA, cuya liberación parece ser dependiente de la articulación afectada. Además, 6 neopéptidos pertenecientes a APOA4, ITIH4, CO3 y KNG1 se han visto alterados en muestras agrupadas de suero de pacientes OA y donantes sanos, aunque en este caso no se han realizado análisis estadísticos confirmatorios. Por otro lado, se han puesto a punto dos técnicas híbridas de inmunoafinidad acopladas a espectrometría de masas (IA-MS) para la detección de dos proteínas específicas de cartílago (CILP1 y PRG4) en muestras de suero. Se ha desarrollado un ensayo iMALDI para la detección de PRG4 y otro de SISCAPA-MRM para el análisis de CILP1. Aunque la tendencia de estas proteínas se ve aumentada en pacientes OA frente a controles sanos, esta alteración no llega a ser significativa en la pequeña cohorte de muestras séricas analizadas

[Resumo] Hai máis de 200 enfermidades reumáticas, que son a segunda causa de incapacitación a nivel mundial e afectan a preto de 2.000 millóns de persoas, principalmente mulleres. Esta tese céntrase especialmente en dúas das máis comúns: a artrose (OA) e a artrite reumatoide (RA). A pesar das diferenzas entre elas, todas producen síntomas similares (dor, rixidez e incluso perda de funcionalidade articular), aínda que os actuais diagnósticos e tratamentos son limitados. O diagnóstico estándar inclúe o uso de técnicas de imaxe, que poden ser prexudiciais para o paciente, e a análise de marcadores non específicos. O tratamento da OA está dirixido a aliviar a dor e mellorar a funcionalidade das articulacións, podendo incluso ser necesaria a substitución articular; mentres que o da RA inclúe varias estratexias terapéuticas mediante proba-erro. Debido a estas limitacións no diagnóstico e tratamento, hai unha gran necesidade de atopar biomarcadores que faciliten a comprensión dos procesos patolóxicos que teñen lugar co fin de especificar mellor o diagnóstico e o tratamento eficaz para o manexo destas enfermidades. Particularmente, nesta tese, realizáronse diferentes estudos proteómicos baseados na espectrometría de masas (MS) e inmunoensaios, co fin de atopar proteínas con potencial papel biomarcador en RA e OA e facilitar así a súa clasificación, diagnóstico e posterior selección de terapias eficaces. No primeiro estudo, levouse a cabo a busca dun panel de proteínas biomarcadoras para controlar a actividade da enfermidade en pacientes con RA, unha das principais limitacións para a correspondente selección de terapias eficaces e específicas que axudan a remitir os característicos episodios agudos desta patoloxía. Inicialmente, un grupo de 11 proteínas candidatas foi identificado por MS e cuantificación relativa co etiquetado de iTRAQ, en mostras de plasma agrupadas e deplecionadas de pacientes con RA con actividades de enfermidade extrema. Para confirmar a tendencia destas 11 proteínas, analizáronse 80 mostras plasmáticas individuais de pacientes con RA con diferentes actividades de enfermidade mediante MS dirixida, coa axuda de péptidos marcados estándar, das que 5 verificáronse como biomarcadores potenciais. Finalmente, 4 delas (SAA1, AACT, HPT e A1AG1) foron validadas por ELISA en 420 mostras de plasma de pacientes con RA, doantes sans e controis doutras enfermidades análogas. Así, este panel validado podería ser útil para o diagnóstico de enfermidades reumáticas inflamatorias autoinmunes como a RA e o seguimento da actividade da enfermidade, crucial para un seguimento e tratamento adecuados. No segundo e terceiro estudos, leváronse a cabo dous tipos diferentes de técnicas proteómicas máis emerxentes para atopar biomarcadores na OA. Por unha banda, leváronse a cabo dous estudos peptidómicos independentes mediante MS en secretomas de cartilaxe e en mostras de líquido sinovial e soro de pacientes con OA e doantes sans. A peptidómica pode ser de grande interese na OA, xa que a deterioración da cartilaxe está ligada a diversos procesos, entre os que destaca a acción das proteasas que producen neopéptidos con posible papel biomarcador para o diagnóstico ou o seguimento da OA. Así, 8 neopéptidos de PRELP, CLUS, CILP1, COMP e MGP víronse significativamente alterados nos secretomas de cartilaxe de pacientes con OA, cuxa liberación parece depender tamén da articulación afectada. Ademais, 6 neopéptidos pertencentes a APOA4, ITIH4, CO3 e KNG1 mostráronse alterados en mostras séricas agrupadas de pacientes con OA e doantes sans, aínda que neste caso non se realizaron análises estatísticas confirmativas. Doutra banda, desenvolvéronse dúas técnicas híbridas de inmunoafinidade acopladas a espectrometría de masas (IA-MS) para a detección de dúas proteínas de cartilaxe específicas (CILP1 e PRG4) en mostras de soro. Elaborouse un ensaio inmuno-MALDI (iMALDI) para a detección de PRG4 e outro de SISCAPA-MRM para a análise de CILP1. Aínda que a tendencia destas proteínas vese aumentada en pacientes con OA fronte a controis saudables, esta alteración non se fai significativa na pequena cohorte de mostras de soro analizadas.