Validation of a Panel of Osteoarthritis Biomarkers by Protein Microarrays

Abstract

[Resumen] Aunque la artrosis (OA) es una patología reumática caracterizada por una larga fase inicial clínicamente silente de deterioro articular, generalmente la enfermedad no se diagnostica hasta etapas muy avanzadas, donde la única solución posible es un reemplazamiento protésico. Esto es mayormente debido a las limitaciones y a la baja sensibilidad que presentan las técnicas de diagnóstico actuales, basadas en la descripción subjetiva de los síntomas del paciente y en pruebas radiológicas. En los últimos años, el uso de técnicas proteómicas ha dado lugar a una larga lista de marcadores solubles asociados con la patología artrósica, que podrían tener cierto potencial para el diagnóstico precoz y/o la predicción de la enfermedad. Sin embargo, ninguno de ellos ha sido suficientemente validado para su uso en la rutina clínica, debido principalmente a la falta de estudios prospectivos en un gran número de muestras procedentes de pacientes que hayan sido seguidos durante largos períodos de tiempo. En esta tesis se han empleado técnicas proteómicas rápidas y económicas, basadas en microarrays de proteínas en suspensión, para la validación y posterior cualificación como marcadores de predicción de incidencia de OA de un panel de seis proteínas seleccionadas en base a resultados previos de nuestro grupo de investigación. Así mismo, a pesar de que no se conoce la causa exacta que inicia el proceso artrósico, es bien sabido que el sistema inmune, entre otros, tiene un papel fundamental. La producción de anticuerpos frente a antígenos propios del cuerpo, o autoanticuerpos (AAbs) es una de las principales características de la actuación de dicho sistema. Por ello, durante la realización de esta tesis doctoral, se llevó a cabo una fase de descubrimiento de biomarcadores mediante arrays de proteínas en formato plano, con el fin de definir un perfil de inmunoreactividad propio de las etapas clínicamente silentes de la OA que permitiera identificar un panel de AAbs con posible potencial como marcadores de predicción. Los resultados obtenidos mediante el análisis de un amplio set de muestras de suero a tiempo cero de individuos sin evidencia ni radiográfica ni sintomática de OA de rodilla, procedentes de la cohorte de la Osteoartrhritis Initiative, han demostrado la asociación de distintos biomarcadores protéicos con la futura aparición de la enfermedad. Por otro lado, el uso de pruebas estadísticas multivariantes ha dado lugar a la generación de dos posibles modelos para predecir la incidencia de OA radiográfica de rodilla, formados por la combinación de marcadores protéicos y clínicos asociados con el desarrollo de la enfermedad. Además, mediante el empleo de análisis de supervivencia, se ha demostrado que los niveles en suero a tiempo cero de estos biomarcadores solubles se asocian con el tiempo de aparición de la misma: a mayores niveles del biomarcador, antes se desarrolla la OA.

[Resumo] Aínda que a artrose (OA) é unha patoloxía reumática caracterizada por unha longa fase inicial clinicamente silente de deterioración articular, xeralmente a enfermidade non se diagnostica ata etapas moi avanzadas, onde a única solución posible é un reemplazamiento protésico. Isto, é maiormente debido ás limitacións e á baixa sensibilidade que presentan as técnicas de diagnóstico actuais, baseadas na descrición subxectiva dos síntomas do paciente e en probas radiolóxicas. Nos últimos anos, o uso de técnicas proteómicas deu lugar a unha longa lista de marcadores solubles asociados coa patoloxía artrósica, que poderían ter certo potencial para o diagnóstico precoz e/ou a predición da enfermidade. Con todo, ningún deles foi suficientemente validado para o seu uso na rutina clínica, debido principalmente á falta de estudos prospectivos nun gran número de mostras procedentes de pacientes que fosen seguidos durante longos períodos de tempo. Nesta tese empregáronse técnicas proteómicas rápidas e económicas, baseadas en microarrays de proteínas en suspensión, para a validación e posterior cualificación como marcadores de predición de incidencia de OA dun panel de seis proteínas seleccionadas en base a resultados previos do noso grupo de investigación. Así mesmo, a pesar de que non se coñece a causa exacta que inicia o proceso artrósico, é ben sabido que o sistema inmune, entre outros, ten un papel fundamental. A produción de anticorpos fronte a antíxenos propios do corpo, ou autoanticorpos (AAbs) é unha das principais características da actuación devandito sistema. Por iso, durante a realización desta tese doutoral, levou a cabo unha fase de descubrimento de biomarcadores mediante arrays de proteínas en formato plano, co fin de definir un perfil de inmunoreactividad propio das etapas clinicamente silentes da OA que permitise identificar un panel de AAbs con posible potencial como marcadores de predición. Os resultados obtidos mediante a análise dun amplo set de mostras de soro a tempo cero de individuos sen evidencia nin radiográfica nin sintomática de OA de xeonllo, procedentes da cohorte da Osteoartrhritis Initiative, demostraron a asociación de distintos biomarcadores protéicos coa futura aparición da enfermidade. Doutra banda, o uso de probas estatísticas multivariantes deu lugar á xeración de dous posibles modelos para predicir a incidencia de OA radiográfica de xeonllo, formados pola combinación de marcadores protéicos e clínicos asociados co desenvolvemento da enfermidade. Ademais, mediante o emprego de análise de supervivencia, demostrouse que os niveis en soro a tempo cero destes biomarcadores solubles asócianse co tempo de aparición da mesma: A maiores niveis do biomarcador, antes desenvólvese a OA

[Abstract] Although osteoarthritis (OA) is a rheumatic pathology characterized by a long clinically silent early phase of joint degeneration, the disease is generally diagnosed at advanced stages, when the only possible solution is prosthetic replacement. This is mainly due to the limitations and low sensitivity of the actual diagnostic techniques, which are based on the patient’s subjective description of the symptoms and radiological tests. In the last years, the use of proteomic technologies have defined a large list of potential OA soluble biomarkers, which may have a putative utility for the early diagnosis and/or prediction of the disease. However, none of them has been sufficiently validated for their use in the daily clinical routine, mostly due to the lack of prospective studies in a large number of individuals who have been followed for long periods of time. In this thesis project, a high-throughput proteomic technique based on suspension protein arrays has been employed for the validation and subsequent qualification as prognostic markers of incident OA of a panel of six proteins selected based on previous findings from our research group. Likewise, despite the exactly mechanism involving the onset of the osteoarthritic pathogenesis remains still unknown, the fundamental role of the immune system, among others, is well documented. The production of antibodies against self-antigens, or autoantibodies (AAbs) is one of the main features of the humoral response. Therefore, as part of this thesis, a biomarker discovery phase using planar protein arrays was carried out in order to detect a specific immunoreactivity signature of the very early stage of the disorder, which might determine a panel of OA-associated AAbs with potential use as prognostic biomarkers. The results obtained by the analysis of a large set of sera at baseline from participants without evident radiological or symptomatic knee OA, belonging to the Osteoarthritis Initiative cohort, have proved the association of different protein biomarkers with the future appearance of radiographic knee OA. On the other hand, the use of multivariable logistic regression analysis has resulted in the generation of two potential prognostic models to predict the incidence of knee OA, which combine protein and clinical markers associated with the development of the disease. In addition, using survival analysis, it has been demonstrated that the baseline serum levels of these biochemical markers are associated with the time of occurrence of the disease: the higher the levels, the sooner the disease appears.