Identificación de nuevas dianas moleculares de la E3 ubiquitina-ligasa Hakai

Abstract

Los carcinomas representan el tipo de cáncer más común (80% de tumores malignos) y son el resutado de la transformación de células epiteliales. Uno de los procesos clave en el desarrollo de adenoma a carcinoma es la transición epitelio mesénquima (TEM), que es el resultado de la movilidad y proliferación celular, así como la alteración de las uniones celulares y célula-matriz, promoviendo la actividad metastásica de las células tumorales. Uno de los miembros mejor caracterizados de las uniones célula-célula (unión adherente), es la E-Cadherinas, y su desaparición de los contactos celulares está considerada como un biomarcador de la TEM. El descubrimiento de la E3 ubiquitina-ligasa, Hakai, abrió un mundo de posibilidades a la hora del estudio de la TEM. La función de Hakai es la de la ubiquitnización de la E-Cadherina promoviendo su degradación vía lisosoma y fomentando, por tanto, la TEM. Además de la E-Cadherina, Hakai tiene otro substrato descrito, el de la proteína citoesquelética Cortactina, la cual tiene un papel importante en la formación de prolongaciones celulares y el incremento de la motilidad celular en procesos carcinogénicos. El objetivo de este trabajo fue el de identificar proteínas reguladas por Hakai que pueden ser substratos de su acción como E3 ubiquitina-ligasa, así como, el de encontrar nuevas vías de señalización en las que Hakai pueda estar implicado. Primero se llevaron a cabo estudios de Western Blot, microscopía de contraste de fases e inmunofluorescencia; a partir de células y extractos proteicos de 3 líneas tumorales distintas: una línea tumoral epitelial normal, MDCK (Madin-Darby canine kidney), y dos líneas que sobreexpresan Hakai de forma estable, MDCK-Hakai4 y MDCK-Hakai11. A continuación se llevó a cabo un estudió proteómico basado en un marcaje iTRAQ (Isobaric tags for relative and absolute quantification), en el que se utilizaron estas mismas líneas celulares. Posteriormente, la detección de nuestras proteínas de interés se realizó mediante espectometría de MS/MS. Finalmente se analizaron los datos obtenidos mediante la utilización de distintos programas de análisis informático.