Estudio de la función de los canales de conexina en condrocitos de cartílago adulto

Abstract

El cartílago articular se caracteriza por ser un tejido avascular, aneuronal y alinfático que recubre las superficies óseas de las articulaciones. Está formado células denominadas condrocitos y por una densa matriz extracelular. Los condrocitos sólo ocupan de un 2-5% del volumen total del tejido y se encuentran embebidos en la matriz, localizados en lagunas y separados uno de otros de 5 a 60μm. Las uniones gap (UG) están formadas por proteínas de la familia de las conexinas (Cxs) y son canales que conectan directamente el citoplasma de dos células adyacentes lo que permite el intercambio de pequeñas moléculas. En diferentes estudios, utilizando modelos animales, se ha descrito que los condrocitos articulares expresan conexina 43 (Cx43); esto combinado con resultados previos de nuestro grupo donde se demuestra que los condrocitos son capaces de formar proyecciones citoplasmáticas de hasta 200μm de longitud, llevó al desarrollo de este trabajo donde se pretende estudiar y caracterizar la funcionalidad de los canales de Cxs en condrocitos humanos combinado con el estudio de la implicación de los canales en otros procesos como la proliferación y regulación del ciclo celular. Para llevar a cabo el estudio, los condrocitos se cultivaron durante 3-5 semanas a 37ºC y 5%CO2 en un incubador. Posteriormente se realizaron ensayos de PCR a tiempo real e inmunohistoquímcia que permitieron determinar la expresión de Cxs en cartílago y su localización en las diferentes capas. La funcionalidad de los canales fue testada mediante la técnica del dual voltage-clamp y la capacidad de intercambio de moléculas mediante un co-cultivo en transwel y espectometría de masas. Para testar si los canales de Cxs estaban implicados en otros procesos como proliferación, se trató a los condrocitos primarios en cultivo con drogas inespecíficas que bloquean los canales de Cxs y el efecto sobre el ciclo celular fue analizado mediante citometría de flujo y ensayos de expresión génica. Los resultados demuestran que los condrocitos en cultivo provenientes de donantes sanos expresan altos niveles de Cx43 que se localiza en múltiples puntos de la membrana plasmática. Los resultados aquí mostrados demuestran que los canales formados por Cx43 son canales funcionales dependientes de voltaje y formados exclusivamente por Cx43. Hemos demostrado que los condrocitos a través de los canales de Cxs intercambian moléculas como Lucifer Yellow u oligos de 12 nucleótidos. Además el co-cultivo en transwell reveló que los condrocitos se transfieren aminoácidos libres como L-lisina y posiblemente, péptidos y proteínas. El efecto sobre el ciclo celular determinó que el bloqueo de los canales de Cxs arresta a las células en G0/G1, afectado a la expresión de proteínas implicadas en la regulación del ciclo celular.