Desarrollo de nuevos procedimientos rápidos y eficaces para evaluar in situ la sensibilidad o resistencia bacteriana a distintos tipos de antibióticos

Abstract

[Resumen]: La resistencia antibiótica es un grave problema de salud pública mundial. Los antibiogramas clásicos habitualmente requieren 18-24 horas, pero en situaciones críticas puede ser decisiva una caracterización rápida y precisa de la cepa bacteriana.Esta tesis desarrolla procedimientos para determinar la sensibilidad/resistencia antibiótica en bacterias de alta patogenicidad, de forma simple, rápida y eficaz. Todos tienen en común la inmovilización de las bacterias en un microgel para su observación bajo microscopía de fluorescencia.Para cada tipo de antibiótico se estableció y validó un parámetro fenotípico que permite discriminar cepas resistentes de sensibles. Las quinolonas, que inducen roturas del ADN, fueron evaluadas mediante visualización directa de la fragmentación del nucleoide. En el caso de antibióticos que inhiben la síntesis del peptidoglicano, la afectación de la pared bacteriana se determinó mediante la promoción de la liberación del nucleoide o de la elongación celular. La colistina, que actúa sobre la membrana plasmática, mostró afectación secundaria en ADN y pared celular. Los antibióticos que inhiben la síntesis proteica, se evaluaron por prevención de procesos autolíticos inducidos en Gram-positivos y de la elongación por respuesta SOS provocada por mitomicina C en Gram-negativos.Los resultados se obtuvieron entre 40-210 minutos, concordando prácticamente con los antibiogramas estándar.

[Resumo]: A resistencia antibiótica é un grave problema de saúde pública mundial. Os antibiogramas clásicos habitualmente requiren 18-24 horas, pero en situacións críticas pode ser decisiva unha caracterización rápida e precisa da cepa bacteriana.Esta tese desenvolve procedementos para determinar a sensibilidade/resistencia antibiótica en bacterias de alta patoxenicidade, de forma simple, rápida e eficaz. Todos teñen en común a inmobilización das bacterias nun microxel para a súa observación baixo microscopía de fluorescencia.Para cada tipo de antibiótico estableceuse e validouse un parámetro fenotípico que permite discriminar cepas resistentes de sensibles. As quinolonas, que inducen roturas do ADN, foron avaliadas mediante visualización directa da fragmentación do nucleoide. No caso de antibióticos que inhiben a síntese do peptidoglicano, a afectación da parede bacteriana determinouse mediante a promoción da liberación do nucleoide ou da elongación celular. A colistina, que actúa sobre a membrana plasmática, mostrou afectación secundaria en ADN e parede celular. Os antibióticos que inhiben a síntese proteica, avaliáronse por prevención de procesos autolíticos inducidos en Gram-positivos e da elongación por resposta SOS provocada por mitomicina C en Gram-negativos.Os resultados obtivéronse entre 40-210 minutos, concordando practicamente cos antibiogramas estándar.

[Abstract]: Antibiotic resistance is a serious global public health problem. Classical antibiograms usually require 18-24 hours, but in critical situations a rapid and accurate characterisation of the bacterial strain can be decisive.This thesis develops procedures to determine antibiotic sensitivity/resistance in highly pathogenic bacteria in a simple, fast and efficient way. All of them have in common the immobilisation of the bacteria in a microgel for observation under fluorescence microscopy.For each type of antibiotic, a phenotypic parameter was established and validated to discriminate between resistant and sensitive strains. Quinolones, which induce DNA breaks, were evaluated by direct visualisation of nucleoid fragmentation. For antibiotics that inhibit peptidoglycan synthesis, bacterial wall damage was determined by promoting nucleoid release or cell elongation. Colistin, which acts on the plasma membrane, showed secondary involvement in DNA and cell wall. Antibiotics that inhibit protein synthesis were evaluated for the prevention of autolytic processes induced in Gram-positives and elongation due to SOS response caused by mitomycin C in Gram-negatives.The results were obtained between 40-210 minutes, in close agreement with standard antibiograms.