New signaling pathways implicated in resistance to targeted therapy in tumors with alterations of the MAPK pathway

Abstract

[Abstract] Mutations in the oncogenic protein kinase BRAF are involved in the onset and progression of several tumours, including more than 50% of melanoma cases and around 8% of all cancers worldwide. Currently, BRAF/MEK inhibitors (BRAF/MEKi) are the standard therapy for BRAFmutated melanoma and have radically changed the treatment landscape of advanced BRAF mutation-positive tumours. However, limited efficacy and emergence of drug resistance are major handicaps for successful treatments. The channel protein connexin43 (Cx43), allows the exchange of small molecules such as ions, metabolites or small RNAs (sRNAs) via hemichannels, gap junctions and thought small extracellular vesicles (EVs), affecting of cell growth, metabolism, and differentiation. Cx43 has also been detected at the mitochondrial associated membranes (MAMs) and it has been identified as a potential tumour suppressor in primary melanoma. However, the molecular basis of its role in disease progression remains controversial. In this project, we aim to unravel de role of Cx43 in the context of BRAF mutated cancer and resistance to therapy in BRAF-mutated tumours. Our findings show that Cx43 enhances the efficacy of BRAF/MEKi in various BRAF-driven tumours in vitro and in vivo models, by attracting DNA repair complexes to the nuclear membrane by interacting with lamin-A/C and different DDR proteins such as HMGB1, PRPF19, XCRR6 or CDCL5. This nuclear compartmentalisation restrict HR pathways and delay DNA repair leading to persistent DNA damage, contribuing to genome instability and synthetic lethality. The results of this thesis demonstrated that targeting Cx43 to interfere with DNA repair could emerge as a potential therapeutic strategy to increase efficacy and to overcome drug resistance in tumours with a BRAF mutant background. In light of our findings, we designed an innovative drug combination by using EVs as drug delivery systems to deliver the full-Cx43 (mRNA and protein) in combination with the BRAF/MEKi. Our results have shown that Cx43 not only increases the internalisation capacity of EVs into receptor cells but also modifies their cargo through the recruitment of new proteins and different molecules of RNAs. The modification of the cargo of these EVs could have an impact on their physiological functions, as we have observed that both sensitive and resistant tumour cells are affected by treatment with these particles, especially when they are in combination with BRAF/MEKi. Furthermore, it has been observed that Cx43 impacts the metabolism of tumour cells by enhancing mitochondrial content and increasing their capacity for respiration through oxidative phosphorylation in BRAFV600E melanoma cells. In addition, Cx43 is present in the endoplasmic reticulum (ER) of melanoma cells, suggesting its role as a novel regulator of ERrelated stress pathways, potentially leading to cell death. Overall, our study highlights novel functions of Cx43, demonstrating for the first time that Cx43 is a novel factor contributing to DNA repair response and BRAF/MEKi efficacy, as well as a key player in the regulation of ER stress, highlighting the potential of Cx43 as an antitumour agent and enhancer of therapy efficacy, as well as a bypass for drug resistance acquisition in BRAF-mutant tumours.

[Resumen] Las mutaciones en la proteína quinasa oncogénica BRAF están directamente relacionadas con la aparición y progresión de varios tipos de tumores, incluyendo más del 50% de los casos de melanoma y aproximadamente el 8% de todos los cánceres en el mundo. En la actualidad, los inhibidores de BRAF/MEK (BRAF/MEKi) son considerados la terapia estándar para los melanomas que presentan mutaciones en BRAF, y han modificado drásticamente el panorama del tratamiento de los tumores avanzados con esta característica genética. Sin embargo, su efectividad es limitada y la resistencia a estos fármacos constituye un obstáculo significativo para el éxito del tratamiento. La proteína transmembrana conexina43 (Cx43) facilita el intercambio de pequeñas moléculas, como iones, metabolitos y ARN pequeños, a través de diferentes mecanismos celulares como uniones comunicantes (GJs), hemicanales o vesículas extracelulares (EVs), afectando aspectos clave como el crecimiento, metabolismo y diferenciación celular. Además, se ha identificado a la Cx43 en las membranas asociadas a las mitocondrias (MAMs) y se ha sugerido como un potencial supresor tumoral en el melanoma primario. Sin embargo, su papel molecular exacto en la progresión de la enfermedad aún es motivo de controversia. En este proyecto, nuestro objetivo es dilucidar el papel de la Cx43 en el contexto de cánceres con mutación en BRAF y en la resistencia a la terapia asociada a dichas mutaciones. Nuestros hallazgos indican que la Cx43 mejora la eficacia de los inhibidores de BRAF/MEK en varios modelos de tumores BRAF-mutados, tanto in vitro como in vivo. Este efecto se logra atrayendo complejos de reparación del ADN hacia la membrana nuclear a través de la interacción con diversas proteínas, como lamin-A/C y diferentes proteínas de reparación del ADN. Esta compartimentación nuclear restringe las vías de reparación del ADN, lo que conduce a daños persistentes en el genoma y contribuye a la inestabilidad genómica y a la letalidad sintética. Nuestros resultados sugieren que la Cx43 podría ser usada como una estrategia terapéutica prometedora para mejorar la eficacia y superar la resistencia a los fármacos en tumores con mutaciones en BRAF. En base a nuestros resultados, hemos desarrollado una combinación innovadora de fármacos utilizando EVs como vehículos de administración para entregar la Cx43 completa (ARNm y proteína) junto con los BRAF/MEKi. Descubrimos que la Cx43 no solo aumenta la capacidad de internalización de las EVs en las células receptoras, sino que también modifica su contenido, lo que afecta tanto a las células tumorales sensibles como a las resistentes, especialmente cuando se combinan con los BRAF/MEKi. Además, hemos observado que la Cx43 impacta en el metabolismo celular de las células de melanoma BRAF mutado, aumentando el estrés del retículo endoplásmico (RE), lo que podría estar provocando un aumento en el contenido mitocondrial y la capacidad respiratoria de las células. En conjunto, nuestro estudio destaca nuevas funciones de la Cx43, demostrando su contribución a la respuesta de reparación del ADN, la eficacia de BRAF/MEKi y la regulación del estrés del RE en tumores con mutaciones en BRAF. Estos hallazgos resaltan el potencial de la Cx43 como un agente antitumoral y potenciador de la eficacia terapéutica, así como un objetivo para combatir la resistencia a los fármacos en tumores con mutaciones en BRAF.

[Resumo] As mutacións na proteína quinasa oncoxénica BRAF están directamente relacionadas coa aparición e progresión de varios tipos de tumores, incluíndo máis do 50% dos casos de melanoma e aproximadamente o 8% de todos os cancros no mundo. Na actualidade, os inhibidores de BRAF/MEK (BRAF/MEKi) son considerados a terapia estándar para os melanomas que presentan mutacións en BRAF, e modificaron drasticamente o panorama do tratamento dos tumores avanzados con esta característica xenética. Con todo, a súa efectividade é limitada e a resistencia a estes fármacos constitúe un obstáculo significativo para o éxito do tratamento. A proteína transmembrana conexina43 (Cx43) facilita o intercambio de pequenas moléculas, como ións, metabolitos e ARN pequenos, a través de diferentes mecanismos celulares como unións comunicantes (GJs), hemichanles ou vesículas extracelulares (EVs), afectando aspectos clave como o crecemento, metabolismo e diferenciación celular. Ademais, identificouse á Cx43 nas membranas asociadas ás mitocondrias (MAMs) e suxeriuse como un potencial supresor tumoral no melanoma primario. Con todo, o seu papel molecular exacto na progresión da enfermidade aínda é motivo de controversia. Neste proxecto, o noso obxectivo é dilucidar o papel da Cx43 no contexto de cancros con mutación en BRAF e na resistencia á terapia asociada ás devanditas mutacións. Os nosos achados indican que a Cx43 mellora a eficacia dos inhibidores de BRAF/MEK en varios modelos de tumores BRAF-mutados, tanto in vitro como in vivo. Este efecto lógrase atraendo complexos de reparación do ADN cara á membrana nuclear a través da interacción con diversas proteínas, como lamin-A/C e diferentes proteínas de reparación do ADN. Esta compartimentación nuclear restrinxe as vías de reparación do ADN, o que conduce a danos persistentes no xenoma e contribúe á inestabilidade xenómica e á letalidade sintética. Os nosos resultados suxiren que a Cx43 podería ser usada como unha estratexia terapéutica prometedora para mellorar a eficacia e superar a resistencia aos fármacos en tumores con mutacións en BRAF. En base aos nosos resultados, desenvolvemos unha combinación innovadora de fármacos utilizando EVs como vehículos de administración para entregar a Cx43 completa (ARNm e proteína) xunto cos BRAF/MEKi. Descubrimos que a Cx43 non só aumenta a capacidade de internalización das EVs nas células receptoras, senón que tamén modifica o seu contido, o que afecta tanto as células tumorais sensibles como ás resistentes, especialmente cando se combinan cos BRAF/MEKi. Ademais, observamos que a Cx43 impacta no metabolismo celular das células de melanoma BRAF mutado, aumentando a tensión do retículo endoplásmico (RE), o que podería estar a provocar un aumento no contido mitocondrial e a capacidade respiratoria das células. En conxunto, o noso estudo destaca novas funcións da Cx43, demostrando a súa contribución á resposta de reparación do ADN, a eficacia de BRAF/MEKi e a regulación da tensión do RE en tumores con mutacións en BRAF. Estes achados resaltan o potencial da Cx43 como un axente antitumoral e potenciador da eficacia terapéutica, así como un obxectivo para combater a resistencia aos fármacos en tumores con mutacións en BRAF.