Diseño y desarrollo de una estrategia para la obtención de un dominio específico de la proteína E3 ubiquitina-ligasa HAKAI

Abstract

[Resumen] La proteína E3 ubiquitina-ligasa HAKAI fue el primer regulador post-traduccional descrito para la estabilidad de la E-cadherina. La E-cadherina es una proteína transmembrana con un papel destacado en funciones de especial relevancia como el mantenimiento de la morfología, polaridad y diferenciación celular, por lo que su pérdida en los contactos celulares conduce a un aumento en la capacidad migratoria e invasiva de las células. Tanto es así, que la expresión disminuida de E-cadherina es un marcador que se asocia a la transición de adenomas (tumores benignos) a carcinomas (tumores malignos). Mecanísticamente, HAKAI media la ubiquitinización de la E-cadherina que conduce a su internalización y posterior degradación y, en consecuencia, induce la invasión y la metástasis en algunos tipos de cáncer. HAKAI reconoce la E-cadherina fosforilada en tirosina y lo hace a través de un dominio de unión atípico, denominado HYB. El dominio HYB forma un homodímero coordinado en zinc, que ha sido propuesto como una diana terapéutica prometedora dado su papel en cáncer. El presente trabajo se planteó con el objetivo de diseñar una estrategia para la obtención del dominio HYB de HAKAI. Para ello, primero se describe el diseño experimental basado en el clonaje de la secuencia codificante para el dominio de interés, HAKAI (106aa-206aa), en un vector de expresión que incluye la proteína GST como etiqueta. Esta etiqueta nos permitirá posteriormente proceder a la purificación de la proteína de fusión por cromatografía de afinidad e, incluso, alcanzar un grado de purificación aún mayor si hace un uso combinado con cromatografía de exclusión molecular. En resumen, estos resultados permitirán explorar más a fondo el potencial del dominio HYB como diana terapéutica en el cáncer al proporcionar un modelo para probar la interacción con sustratos específicos de HAKAI.

[Resumo] A proteína E3 ubiquitina-ligasa HAKAI foi o primeiro regulador post-traducional descrito para a estabilidade da E-cadherina. A E-cadherina é una proteína transmembrana cun papel destacado en función de especial relevancia como o mantemento da morfoloxía, polaridade e diferenciación celular, polo que a súa perda nos contactos celulares conduce a un aumento da capacidade migratoria e invasiva das células. Tanto é así, que a expresión diminuída de E-cadherina é un marcador que se asocia coa transición de adenomas (tumores benignos) a carcinomas (tumores malignos). Mecanísticamente, HAKAI media a ubiquitinización da E-cadherina que conduce á súa internalización e posterior degradación e, en consecuencia, induce a invasión e a metástases nalgúns tipos de cancro. HAKAI recoñece a E-cadherina fosforilada en tirosina e faino a través dun dominio de unión atípico, denominado HYB. O dominio HYB forma un homodímero coordinado en zinc, que foi proposto como unha diana terapéutica prometedora dado o seu papel en cancro. O presente traballo planeouse có obxectivo de deseñar unha estratexia para a obtención do dominio HYB de HAKAI. Para elo, primeiro descríbese o deseño experimental baseado na clonaxe da secuencia codificante para o dominio de interese, HAKAI (106aa-206aa), nun vector de expresión que inclúe a proteína GST como etiqueta. Esta etiqueta permitirá posteriormente proceder á purificación da proteina de fusión por cromatografía de afinidade e, incluso, alcanzar un grado de purificación aínda maior se se fai un uso combinado con cromatografía de exclusión molecular. En resumo, estos resultados permitirán explorar máis a fondo o potencial do dominio HYB como diana terapéutica en cancro ao proporcionar un modelo para probar a interacción con sustratos específicos de HAKAI.

[Abstract] E3 ubiquitin-ligase HAKAI was the first described post-translational regulator of E-cadherin stability. E-cadherin is a transmembrane protein with a prominent role in highly relevant functions such as maintenance of morphology, polarity, and cellular differentiation. For this reason, its loss at cell contacts leads to an increase in the migratory and invasive capacity of cells. Indeed, that a decreased expression of E-cadherin is a marker associated to the transition of adenomas (benign tumors) to carcinomas (malignant tumors). Regarding the molecular mechanism, HAKAI is responsible of the ubiquitination of E-cadherin leading to its internalization and subsequent degradation. This in turn leads to invasion and metastasis in some kind of cancer. HAKAI recognizes tyrosine-phosphorylated E-cadherin through an atypical binding domain, named HYB. The HYB domain forms a zinc-coordinated homodimer, proposed as a promising therapeutic target due to its involvement in cancer. The present work has been proposed with the objective of designing a strategy to obtain HAKAI’s HYB domain. For that purpose, the experimental design is first described with the cloning of the coding sequence for the aforementioned domain, HAKAI (106aa-206aa) in an expression vector that includes the GST protein tag. This tag will allow us to subsequently purify the fusion protein through affinity chromatography and even reach a higher degree of purification if combined with molecular exclusion chromatography. To summarize, these results will allow us to further explore the potential of the HYB domain as a therapeutic target in cancer by providing a model to test the interaction of HAKAI with specific substrates.