Captura de exosomas humanos utilizando Tim4 en levaduras

Abstract

[Resumen]: Los exosomas son un tipo de vesículas extracelulares cuya biogénesis se encuentra en la vía endosómica de las células. La secreción de estas es un proceso evolutivamente conservado y está comprobado que juegan un papel esencial en la comunicación intercelular. Estas vesículas pueden transportar proteínas transmembrana o componentes citoplasmáticos, de modo que se ha comprobado su potencial como biomarcador no invasivo para el diagnóstico de varias enfermedades. Sin embargo, actualmente los protocolos de extracción son laboriosos y caros, por lo que es necesario el desarrollo de nuevas técnicas. En este trabajo se busca desarrollar un nuevo protocolo de aislamiento de exosomas humanos expresando una parte de la proteína Tim4 en la superficie de las levaduras. Dicha proteína es capaz de reconocer residuos de fosfatidilserina presentes en los exosomas. Por un lado, se transformó la cepa de Saccharomyces cerevisiae EBY100 con el plásmido pYD1 que contiene una parte de la secuencia del gen TIM4 y se indujo la expresión de esta proteína en la superficie de la membrana de la levadura. Por otro lado, se cultivó la línea de células humanas PC3 (provenientes de un cáncer de próstata) y del medio de cultivo se aislaron exosomas utilizando dos métodos: un método clásico de ultracentrifugación y nuestro método utilizando levaduras.

[Resumo]: Os exosomas son un tipo de vesículas extracelulares cuxa bioxénesis atópase na vía endosómica das células. A secreción destas é un proceso evolutivamente conservado e está comprobado que xogan un papel esencial na comunicación intercelular. Estas vesículas poden transportar proteínas transmembrana ou compoñentes citoplasmáticos, de modo que se comprobou o seu potencial como biomarcador non invasivo para o diagnóstico de varias enfermidades. Non obstante, actualmente os protocolos de extracción son laboriosos e caros, polo que é necesario o desenvolvemento de novas técnicas. Neste traballo búscase desenvolver un novo protocolo de illamento de exosomas humanos expresando unha parte da proteína Tim4 na superficie dos lévedos. Dita proteína é capaz de recoñecer residuos de fosfatidilserina presentes nos exosomas. Por unha banda, transformouse a cepa de Saccharomyces cerevisiae EBY100 co plásmido pYD1 que contén unha parte da secuencia do xene TIM4 e induciuse a expresión desta proteína na superficie da membrana do lévedo. Doutra banda, cultivouse a liña de células humanas PC3 (provenientes dun cancro de próstata) e do medio de cultivo illáronse exosomas utilizando dous métodos: un método clásico de ultracentrifugación e o noso método utilizando lévedos.

[Abstract]: Exosomes are a type of extracellular vesicles whose biogenesis is found in the endosomal pathway of cells. Their secretion is an evolutionarily conserved process and they have been shown to play an essential role in intercellular communication. These vesicles can transport transmembrane proteins or cytoplasmic components, so their potential as a noninvasive biomarker for the diagnosis of various diseases has been proven. However, current extraction protocols are laborious and expensive, so new techniques need to be developed. In this work we aim to develop a new protocol for the isolation of human exosomes by expressing a part of the Tim4 protein on the yeast surface. This protein can recognize phosphatidylserine residues present in exosomes. On the one hand, the Saccharomyces cerevisiae strain EBY100 was transformed with the plasmid pYD1 containing a part of the TIM4 gene sequence and the expression of this protein was induced on the yeast membrane surface. On the other hand, the human cell line PC3 (from prostate cancer) was cultured, and exosomes were isolated from the culture medium using two methods: a classical ultracentrifugation method and our method using yeasts.