Role of Connexin43 in Triple Negative Breast Cancer and Skin Regeneration After Oncological Treatments

Abstract

[Resumen] El cáncer de mama es el tumor más diagnosticado en todo el mundo y representa la quinta causa de mortalidad por cáncer a nivel mundial. Se trata de una enfermedad muy heterogénea, y uno de sus subtipos, el cáncer de mama triple negativo (TNBC), se caracteriza por presentar mayor agresividad y peor pronóstico, careciendo actualmente de terapias dirigidas eficientes. Entre las estrategias emergentes para tratar el TNBC, es importante destacar las terapias dirigidas al EGFR y la inmunoterapia. Dentro del TNBC son especialmente interesantes los tumores con mutaciones en BRCA1/2, que presentan deficiencias en la reparación del daño en el ADN por recombinación homóloga. La novedosa y prometedora estrategia representada por los inhibidores de PARP (PARPi) aprovecha esta situación y provoca acumulación de daño en el ADN y la consiguiente muerte celular en los tumores con mutaciones BRCA1/2. Sin embargo, los PARPi también se asocian a resistencia tanto de novo como adquirida, lo que acentúa la necesidad de diseñar nuevas estrategias terapéuticas que aborden esta problemática. Las conexinas (Cxs) son proteínas que forman hemicanales y uniones comunicantes (GJs), y participan en la comunicación celular así como en funciones independientes de canal. Se ha descrito que la Cx43 está altamente desregulada en cáncer de mama, sugiriendo que se trata de un supresor tumoral condicional. Sin embargo, todavía existe controversia y su función en la patogénesis y el desarrollo del cáncer de mama depende del subtipo tumoral y está lejos de ser dilucidado. El objetivo principal de esta tesis fue investigar la implicación de la Cx43 (i) en el TNBC, (ii) en la interacción del TNBC con el microambiente tumoral, como fibroblastos y células natural killer (NK) y (iii) en la respuesta al PARPi olaparib. Empleando muestras derivadas de pacientes con cáncer de mama y líneas celulares humanas de TNBC se detectó que la Cx43 estaba profundamente desregulada, y más significativamente en el TNBC. Tras la restauración de Cx43 mediante transfección plasmídica en células TNBC, la proteína se localizó principalmente en la zona perinuclear y, en cierta medida, en la membrana plasmática, donde formó GJs funcionales. Las células TNBC HCC1937 y MDAMB231 en las que se restauró la Cx43 mostraron una reducción significativa de la proliferación celular 2D y 3D, formación de colonias y migración, así como una reversión de la transición epitelio-mesénquima, resensibilización a Anoikis y una mejora en la adhesión a la proteína de matriz extracelular colágeno I. Las células TNBC HCC1937 con mutación BRCA1 restituidas para la Cx43 desencadenaron una respuesta antitumoral más citotóxica por las células primarias y EGFR-CAR NKs que las células tumorales wild type, presumiblemente de forma independiente a la actividad de GJs. Además, la restitución de Cx43 en las HCC1937 las resensibilizó al olaparib, al que las células wild type presentan resistencia de novo, detectándose una reducción de la proliferación y la formación de colonias, acumulación de daño en el ADN y de senescencia, aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno y, finalmente, aumento de la apoptosis mediada por caspasa 3. Estos resultados se recapitularon asimismo en células de carcinoma de ovario con mutación BRCA1. Un objetivo adicional de esta tesis fue abordar un problema clínico aún no resuelto como es la alteración en la cicatrización de heridas y estructura cutánea en pacientes oncológicos después de la radio- o la quimio-terapia. La estrategia propuesta, basada en la combinación del polifenol natural oleuropeína y el inhibidor de p38 BIRB796, actúa sobre la expresión/función de Cx43 y la senescencia celular en fibroblastos humanos irradiados, reduciendo Cx43 pero restaurando su funcionalidad, mejorando la senescencia celular-producción de SASP sobreestimulados por la radioterapia y favoreciendo la migración in vitro. Estos hallazgos indican que la Cx43 podría utilizarse como una doble diana terapéutica capaz de reducir la malignidad tumoral y resensibilizar las células TNBC con mutación BRCA1 a la inmunoterapia con NKs y al PARPi olaparib, así como de contribuir a mejorar la cicatrización de heridas cutáneas tras la radioterapia.

[Resumo] O cancro de mama é o tumor máis diagnosticado en todo o mundo e representa a quinta causa de mortalidade por cancro a nivel mundial. Trátase dunha enfermidade moi heteroxénea, e un dos seus subtipos, o cancro de mama triple negativo (TNBC), caracterízase por presentar maior agresividade e peor prognóstico, carecendo actualmente de terapias dirixidas eficientes. Entre as estratexias emerxentes para tratar o TNBC, é importante salientar as terapias dirixidas ao EGFR e a inmunoterapia. Dentro do TNBC son especialmente interesantes os tumores con mutacións en BRCA1/2, que presentan deficiencias na reparación do dano no ADN por recombinación homóloga. A nova e prometedora estratexia representada polos inhibidores de PARP (PARPi) aproveita esta situación e provoca acumulación de dano no ADN e a consecuente morte celular nos tumores con mutacións BRCA1/2. Con todo, os PARPi tamén se asocian a resistencia tanto de novo como adquirida, o que acentúa a necesidade de deseñar novas estratexias terapéuticas que aborden esta problemática. As conexinas (Cxs) son proteínas que forman hemicanles e unións comunicantes (GJs), e participan na comunicación celular así como en funcións independentes de canle. Describiuse que a Cx43 está altamente desregulada en cancro de mama, suxerindo que se trata dun supresor tumoral condicional. Con todo, aínda existe controversia e a súa función na patoxénese e o desenvolvemento do cancro de mama depende do subtipo tumoral e está lonxe de ser dilucidado. O obxectivo principal desta tese foi investigar a implicación da Cx43 (i) no TNBC, (ii) na interacción do TNBC co microambiente tumoral, como fibroblastos e células natural killer (NK) e (iii) na resposta ao PARPi olaparib. Empregando mostras derivadas de pacientes con cancro de mama e liñas celulares humanas de TNBC detectouse que a Cx43 estaba profundamente desregulada, e máis significativamente no TNBC. Tras a restauración de Cx43 mediante transfección plasmídica en células TNBC, a proteína localizouse principalmente na zona perinuclear e, en certa medida, na membrana plasmática, onde formou GJs funcionais. As células TNBC HCC1937 e MDAMB231 nas que se restaurou a Cx43 amosaron unha redución significativa da proliferación celular 2D e 3D, da formación de colonias e da migración, así como unha reversión da transición epitelio-mesénquima, resensibilización a Anoikis e unha mellora na adhesión á proteína de matriz extracelular coláxeno I. As células TNBC HCC1937 con mutación BRCA1 restituídas para a Cx43 desencadearon unha resposta antitumoral máis citotóxica polas células primarias e EGFR-CAR NKs que as células tumorais wild type, presumiblemente de forma independente á actividade de GJs. Ademais, a restitución de Cx43 nas HCC1937 resensibilizounas ao olaparib, ao que as células wild type presentan resistencia de novo, detectándose unha redución da proliferación e a formación de colonias, acumulación de dano no ADN e de senescencia, aumento da produción de especies reactivas de osíxeno e, finalmente, aumento da apoptose mediada por caspasa 3. Estes resultados se recapitularon así mesmo en células de carcinoma de ovario con mutación BRCA1. Un obxectivo adicional desta tese foi abordar un problema clínico aínda non resolvido como é a alteración na cicatrización de feridas e estrutura cutánea en pacientes oncolóxicos despois da radio- ou a quimio-terapia. A estratexia proposta, baseada na combinación do polifenol natural oleuropeína e o inhibidor de p38 BIRB796, actúa sobre a expresión/función de Cx43 e a senescencia celular en fibroblastos humanos irradiados, reducindo Cx43 pero restaurando a súa funcionalidade, mellorando a senescencia celular-produción de SASP sobreestimulados pola radioterapia e favorecendo a migración in vitro. Estes achados indican que a Cx43 podería utilizarse como unha dobre diana terapéutica capaz de reducir a malignidade tumoral e resensibilizar as células TNBC con mutación BRCA1 á inmunoterapia con NKs e ao PARPi olaparib, así como de contribuír a mellorar a cicatrización de feridas cutáneas tras a radioterapia.

[Abstract] Breast cancer is the most diagnosed cancer worldwide and represents the fifth cause of cancer mortality globally. It is a highly heterogeneous disease, and one of its subtypes, triple negative breast cancer (TNBC), is characterized by the highest aggressiveness and poorest prognosis, currently lacking efficient targeted therapies. Among emerging strategies to treat TNBC, EGFR-targeted therapies and immunotherapy are being critical. Of particular interest within TNBC are BRCA1/2 mutated tumours, which are deficient in DNA damage repair by homologous recombination. The promising new strategy represented by PARP inhibitors (PARPi) can take advantage of this situation and lead to DNA damage accumulation and cell death in BRCA1/2 mutated tumours. However, PARPi have also been associated with both de novo and acquired resistance, accentuating the need to design new therapeutic strategies to address this issue. Connexins (Cxs) are hemichannel and gap junction (GJ)-forming proteins involved in cellular communication and channel-independent functions. Cx43 has been reported to be highly dysregulated in breast cancer and suggested as a conditional tumour suppressor. However, there is still controversy and its role in the pathogenesis and development of breast cancer depends on the subtype and is far from being elucidated. The main aim of this thesis was to investigate the role of Cx43 (i) in TNBC, (ii) in the interaction of TNBC with the tumour microenvironment such as fibroblasts and natural killer (NK) cells and (iii) in the response to PARPi olaparib. Cx43 was found to be deeply downregulated in human breast cancer patient-derived samples and cell lines, and even more in TNBC. Upon restoration of Cx43 by plasmid transfection of TNBC cells, Cx43 mainly localized perinuclearly and to some extent at the plasma membrane, where it formed functional GJs. Cx43-restituted TNBC HCC1937 and MDAMB231 cells showed reduced 2D and 3D proliferation, colony formation and migration, epithelialmesenchymal transition reversion, resensitization to Anoikis and improved adhesion to extracellular matrix protein collagen I. Cx43-restored TNBC BRCA1 mutated HCC1937 cells triggered a more cytotoxic antitumour response of primary and EGFR-CAR-NK cells than wild type tumour cells, presumably in a GJ-independent manner. Moreover, Cx43 restitution in these cells distinctly resensitized them to olaparib, to which the wild type cells are de novo resistant, via reduced proliferation and colony formation, DNA damage and senescence accumulation, enhanced reactive oxygen species production and eventually increased caspase 3-mediated apoptosis. These results were further recapitulated in BRCA1 mutated ovarian carcinoma cells. An additional objective of this thesis was to address the unsolved clinical burden of wound healing impairment in oncological patients after radio- or chemo-therapy. The proposed strategy, based on the combination of natural polyphenol oleuropein and p38 inhibitor BIRB796, targets Cx43 expression/function and cellular senescence in irradiated human fibroblasts, reducing Cx43 but restoring its functionality, ameliorating overstimulated cellular senescence-SASP production and improving in vitro migration. These findings support Cx43 as a double therapeutic target capable of reducing tumoral malignancy and resensitizing TNBC BRCA1 mutated cells to NK immunotherapy and PARPi, and of improving wound healing after radiotherapy.