Puesta a punto de un protocolo de diferenciación condrogénica en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) generadas a partir de pacientes con artrosis de manos y un donante sano.

Abstract

[Resumen] El objetivo del presente trabajo fue poner a punto un protocolo de diferenciación condrogénica en líneas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) obtenidas de pacientes con artrosis de manos (OAm) y un donante sano. Las iPSCs, cultivadas en un medio en feeder, se adaptaron a un sistema libre de feeder compuesto por Laminina y Stemflex. A continuación, se evaluaron 2 protocolos: un protocolo de diferenciación condrogénica dirigida y otro con cuerpos embrionarios (EBs) espontáneos. Además, también se testó la formación de EBs mediante la técnica de hanging drop. Una vez transcurridas las 5 semanas de cultivo, se evaluaron las diferenciaciones de las líneas mediante tinciones histológicas de los esferoides y análisis moleculares de ARN. La línea TC28a2 fue utilizada como control positivo de la diferenciación condrogénica. Las líneas de iPSCs fueron adaptadas al cultivo libre de feeder tras varios intentos. Tras la adaptación, se realizaron los protocolos de diferenciación obteniéndose esferoides de ambas líneas. El análisis histológico y molecular mostró diferenciación condrogénica, aunque los resultados no son concluyentes.

[Resumo] O obxectivo deste traballo foi desenrolar un protocolo de diferenciación condroxénica nas liñas de células nai pluripotentes inducidas (iPSCs) obtidas a partir de pacientes con artrose de mans (OAm) e dun doante san. As iPSCs, cultivadas sobre feeder, adaptáronse a un sistema libre de feeder composto por Laminina e Stemflex. Posteriormente, avaliáronse dous protocolos: un protocolo de diferenciación condroxénica dirixida e outro con corpos embrionarios (EBs) espontáneos. Ademáis, tamén se probou a formación de EBs usando a técnica de hanging drop. Despois das 5 semanas de cultivo, a diferenciación das liñas foi avaliada por tinción histolóxica dos esferoides e análise molecular do ARN. A liña TC28a2 utilizouse como control positivo da diferenciación condroxénica. As liñas de iPSCs adaptáronse ao sistema libre de feeder tras varios intentos. Despois da adaptación, realizáronse os protocolos de diferenciación obtendo esferoides de ambas liñas. As análises histolóxicas e moleculares mostraron diferenciación condroxénica, aínda que os resultados non son concluíntes.

[Abstract] The aim of the present work was to develop a chondrogenic differentiation protocol for induced pluripotent stem cell lines (iPSCs) obtained from patients with hand osteoarthritis (OAm) and a healthy donor. The iPSCs, cultured onto feeder cells, were adapted to a feeder-free system composed of Laminin and Stemflex. Then, 2 protocols were evaluated: a protocol of directed chondrogenic differentiation and another with spontaneous embryonic bodies (EBs). In addition, the formation of EBs was also tested using the hanging drop technique. After the 5 weeks in culture, the differentiation of the lines was evaluated by histological staining of the spheroids and RNA molecular analysis. The TC28a2 line was used as a positive control for chondrogenic differentiation. The iPSCs lines were adapted to free feeder culture after several attempts. After the adaptation, the differentiation protocols were tested obtaining spheroids of both lines. Histological and molecular analysis showed chondrogenic differentiation, although the results are not conclusive.