Criopreservación de córneas: estudio de la viabilidad celular endotelial y de la histomorfología de la córnea

Abstract

[Resumen] El objetivo de este trabajo ha sido evaluar la eficacia de cuatro protocolos de criopreservación diferentes atendiendo a la viabilidad celular endotelial y a la estructura de las córneas tras su descongelación. Un total de n=3 córneas fueron criopreservadas con cada uno de los protocolos siguientes: criopreservación lenta con albúmina (Grupo 1), criopreservación lenta sin albúmina (Grupo 2), criopreservación rápida mediante vitrificación con VS55 (Grupo 3) y criopreservación rápida mediante vitrificación con DP6 (Grupo 4). Tras la descongelación, se realizó sobre dos córneas de cada grupo un ensayo de viabilidad para evaluar la celularidad y la viabilidad de las células endoteliales. Paralelamente, se realizó la tinción de tricrómico de Masson en una córnea descongelada de cada grupo para analizar la estructura histomorfológica. Las córneas del Grupo 4 mostraron, cualitativamente, más celularidad que las córneas del Grupo 3, seguidas de las córneas del Grupo 1 y Grupo 2. Respecto a la viabilidad, el Grupo 1 mostró un 66,79% de células viables, el Grupo 2 presentó muy pocas células viables, y los grupos 3 y 4, ninguna. Los daños de la criopreservación se observaron en los desprendimientos del endotelio en los Grupos 2, 3 y 4, en las oquedades amplias del estroma en los Grupos 1, 3 y 4, y en el estrechamiento y pérdida de células y de volumen celular en el epitelio de todos los grupos. La criopreservación con cualquiera de los cuatro protocolos utilizados aportan celularidades endoteliales altas tras la descongelación, mostrando la mayor celularidad la criopreservación rápida. Sin embargo, la viabilidad celular endotelial se ve más afectada en la criopreservación rápida que en la criopreservación lenta, que sí retiene cierta viabilidad celular. El endotelio, el epitelio y el estroma de la córnea son capas sensibles a los daños de la criopreservación, en especial durante la criopreservación rápida.

[Resumo] O obxectivo deste traballo foi a avaliación da eficacia de catro protocolos de criopreservación diferentes, atendendo á viabilidade celular endotelial e á estrutura das córneas tras a súa desconxelación. Un total de n=3 córneas foron criopreservadas con cada un dos protocolos seguintes: criopreservación lenta con albumina (Grupo 1), criopreservación lenta sen albumina (Grupo 2), criopreservación rápida mediante vitrificación con VS55 (Grupo 3) e criopreservación rápida mediante vitrificación con DP6 (Grupo 4). Tras a desconxelación, realizouse sobre dúas córneas de cada grupo un ensaio de viabilidade para avaliar a celularidade e a viabilidade das células endoteliais. Paralelamente, realizouse a tinguidura de tricrómico de Masson nunha córnea desconxelada de cada grupo para analizar a estrutura histomorfolóxica. As córneas do Grupo 4 mostraron, cualitativamente, máis celularidade que as córneas do Grupo 3, seguidas das córneas do Grupo 1 e Grupo 2. Respecto á viabilidade, o Grupo 1 mostrou un 66,79% de células viables, o Grupo 2 presentou moi poucas células viables, e os grupos 3 e 4, ningunha. Os danos da criopreservación observáronse nos desprendementos do endotelio nos Grupos 2, 3 y 4, nos ocos amplos do estroma nos Grupos 1, 3 y 4, e no estreitamento e perda de células e de volume celular do epitelio de todos os grupos. A criopreservación con calquera dos catro protocolos utilizados aportan celularidades endoteliais altas tras a desconxelación, mostrando a maior celularidade a criopreservación rápida. Sen embargo, a viabilidade celular endotelial vese máis afectada na criopreservación rápida que na criopreservación lenta, que si retén certa viabilidade celular. O endotelio, o epitelio e o estroma da córnea son capas sensibles aos danos da criopreservación, en especial durante a criopreservación rápida.

[Abstract] The aim of this study was the evaluation of four protocols of cryopreservation, attending to the cell endothelial viability and to the cornea structure after thawing. A total of n=3 corneas were cryopreserved using the following: slow cryopreservation with albumin (Group 1), slow cryopreservation without albumin (Group 2), fast cryopreservation with vitrification using VS55 solution (Group 3), fast cryopreservation with vitrification using DP6 solution media (Group 4). After thawing, a viability assay was performed over two corneas to evaluate the cellularity and viability of endothelial cells. A Masson staining was performed in one thawed cornea of each group. Corneas in Group 4 showed the huge cellularity, followed by corneas of Group 3, Group 1 and Group 2. Corneas of Group 1 showed 66,79% of viable cells, while in Group 2 there were very few viable cells, and no viable cells in Groups 3 and 4. Cryoinjuries were observed in endothelium detachment in Groups 2, 3 and 4 and in the holes among collagen fibres of strome in Groups 1, 3 and 4. Also, the thinner epithelial layer and its cell losing in all the groups are cryoinjuries. Cryopreservation with any of the four protocols allow a high endothelial cellularity after thawing. Fast cryopreservation offers the best result in cellularity. Despite of all, endothelial cell viability is affected with fast cryopreservation. Slow cryopreservation retains some cell viability. Endothelium, epithelium and strome are three sensitive layers of cornea that suffer cryoinjuries, in special, when the fast cryopreservation is carries out.