Clonaje, expresión y purificación de FrpAang, una nueva proteína de membrana receptora de sideróforos en Vibrio anguillarum

Abstract

[Resumen]: La creciente importancia adquirida por la industria acuícola se ve reflejada en el espectacular incremento de un 29% en su producción durante el período 2011-2016. Sin embargo, su notable expansión asociada con los efectos del cambio climático lleva pareja la dispersión de patógenos responsables de unas pérdidas anuales para el sector acuícola estimadas en más 6000 millones de dólares por la FAO. Uno de los patógenos más relevantes es Vibrio anguillarum responsable de la vibriosis, una septicemia hemorrágica capaz de afectar a más de 50 especies de peces y moluscos entre los que se encuentran algunos de interés piscícola a nivel mundial. Dentro de sus principales factores de virulencia encontramos a los sistemas de captación de Fe (III) mediados por sideróforos. Estos sistemas han sufrido adaptaciones desde su función ancestral de captación de hierro en condiciones de baja solubilidad en el medio externo, hacia la captación de hierro en el medio interno de los organismos, un medio en donde la disponibilidad de hierro en estado libre alcanza concentraciones attomolares. Recientemente se ha descubierto un nuevo sistema de sideróforos en V. anguillarum. Este sistema es responsable de la síntesis de la piscibactina, sideróforo caracterizado previamente en otro importante patógeno acuícola; Photobacterium damselae subespecie piscicida. El nuevo sistema se une a otros descubiertos previamente en V. anguillarum como son los de la vancrobactina y la anguibactina. La importancia de este nuevo elemento se ha hecho patente tras la secuenciación de un gran número de cepas de V. anguillarum. En este análisis se ha comprobado que el sistema de la piscibactina está presente en buena parte de las cepas con mayor mortalidad asociada (RV22, HI610, DSM 21597, 90-11-286). Esta evidencia ha sido puesta a prueba en ensayos de virulencia con la cepa RV22. En ellos se ha apuntado hacia el sistema de la piscibactina como un importante factor de virulencia, lo que supone una nueva posibilidad de cara a la generación de estrategias frente a V. anguillarum. Por todo ello, en el presente trabajo se propone el clonaje del supuesto receptor de la piscibactina, el gen frpAang, su producción en E. coli y su purificación de cara a un futuro ensayo de vacunación.

[Abstract]: The growing importance acquired by the aquaculture industry is reflected in its recent production increase of 29% over the period of 2011-2016. However, its remarkable expansion in association with climate change effects drives to the dispersion of several associated pathogens responsible for annual losses to the industry estimated at 6000 million dollars according to the FAO. One of the most relevant pathogens is Vibrio anguillarum responsible for the vibriosis, an hemorrhagic septicemia capable of affecting more than 50 species of fish and molluscs among which are some of the fish interest worldwide. One of its main virulence factors are Fe (III) uptake systems mediated by siderophores. These systems have been adapted from their ancestral role of iron uptake in the environment, towards the uptake of iron in the internal environment of the hosts, where the availability of iron in a free state is found in attomolar concentrations. Recently a new siderophore system has been found out in V. anguillarum. This system is responsible for the synthesis of piscibactin, siderophore related with another important aquaculture pathogen; Photobacterium damselae subspecies piscicida. The new system is added to other systems already known in V. anguillarum such as vancrobactin and anguibactin systems. The importance of this new discovery seems to be noted after the recent sequencing of several V. Anguillarum strains. It has been observed that the system is present in much of the strains with higher associated mortality (RV22, HI610, DSM 21597, 90-11-286). This observation has been tested in virulence tests with the strain RV22. These studies point out that the piscibactin system is an important virulence factor, which implies a new possibility for the generation of new strategies against V. anguillarum. With all this knowledge about V. Anguillarum, the present Master Dissertation proposes the cloning of the putative receptor of piscibactin, the coding gene frpAang, its production and purification in E. coli for the development of a future vaccination assay.