Estudio químico de bacterias de origen marino: aislamiento de productos naturales bioactivos, proteínas recombinantes receptoras de sideróforos de bacterias patógenas en peces de acuicultura y síntesis de conjugados de sideróforos con nanopartículas magnéticas

Abstract

[Resumen] Esta Tesis Doctoral está dividida en tres partes. En la primera parte, se describe la importancia de los sistemas de captación de hierro en bacterias patógenas de peces y el uso de proteínas receptoras de sideróforos como potenciales vacunas. En la segunda parte, se sintetizó un conjugado entre el sideróforo feroxamina y nanopartículas magnéticas y se realizaron ensayos de captura con Yersinia enterocolitica WC-A. Finalmente, se determinó la estructura plana y la estereoquímica del tetrapéptido cereusitin A producido por Bacillus cereus RKHC-09 y se detectó e identificó el complejo de Ga(III) de piscibactina en los sobrenadantes de los cultivos de Vibrio anguillarum RV22 y el mutante vabF, con el fin de establecer la importancia del sistema de capatación de hierro mediado por piscibatina en la viruencia de V. anguillarum. Capítulo I En este capítulo se habla de la importancia de la acuicultura y la necesidad de desarrollar nuevos tratamientos para el control de infecciones producidas por bacterias patógenas. Además, se describe de forma general el mecanismo de captación de hierro y las ventajas de emplear proteínas de membrana externa receptoras de sideróforos como vacunas. Se presenta la metodología de clonaje, expresión y purificación de las proteínas recombinantes FvtA (receptor del sideróforo vancrobactina producido por Vibrio anguillarum RV22) y FstC (receptor de los sideróforos amonabactinas biosintetizados por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida VT45). Adicionalmente, se expresó y purificó rFstB (receptor de acinetobactina producido por A. salmonicida subsp. salmonicida VT45). Finalmente, se muestran los resultados obtenidos al ensayar rFvtA, rFstB y rFstC como vacuna en lenguados infectados con vibriosis y forunculosis. Capítulo II Este capítulo está dedicado a la aplicación de sideróforos conjugados con nanopartículas magnéticas para el desarrollo de un mecanismo de detección de bacterias. Se describen las aplicaciones de los sideróforos en diferentes campos junto con el proceso de diseño de nanomateriales magnéticos y la versatilidad de estos para sintetizar conjugados para desarrollar aplicaciones. RESUMEN ii Se describe la síntesis del conjugado entre el sideróforo feroxamina y nanopartículas magnéticas funcionalizadas (MNP@SiO2@NH@Fa), su caracterización y su capacidad de captura de Yersinia enterocolitica WC-A. También, se muestra la síntesis de un análogo de enterobactina que puede ser empleado para la síntesis de conjugados. Capítulo III En este capítulo se hace una breve introducción de la importancia de los microorganismos marinos como productores de productos naturales, su actividad biológica y su gran diversidad estructural. También se expondrán los métodos más generales para la selección de condiciones para el cultivo y obtención de compuestos producidos por bacterias principalmente. Se muestra el proceso de elucidación estructural del tetrapéptido cereusitin A producido Bacillus cereus RKHC-09 mediante experimentos de resonancia magnética nuclear mono y bidimesionales y análisis de espectrometría de masas de baja y alta resolución. Adicionalmente, se determinó la estereoquímica absoluta de los aminoácidos presententes en la molécula por medio del método de Marfey. Finalmente se mostrará el proceso de detección del complejo de Ga(III) de piscibactina en el sobrenadante de cultivo de V. anguillarum RV22 y el mutante vabF por medio de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LCMS).

[Resumo] Esta Tese Doctoral está dividida en tres partes. Na primeira parte, descríbese a importancia dos sistemas de captación de ferro en bacterias patóxenas de peces e o uso de proteínas receptoras de sideróforos como potenciais vacinas. Na segunda parte, sintetizouse un conxugado entre o sideróforo feroxamina e nanopartículas magnéticas e realizáronse ensaios de captura con Yersinia enterocolitica WC-A. Finalmente, determinouse a estrutura plana e a estereoquímica do tetrapéptido cereusitin A producido por Bacillus cereus RKHC-09 e detectouse e identificouse o complexo de Ga(III) de piscibactina nos sobrenadantes dos cultivos de Vibrio anguillarum RV22 e o mutante vabF. Capítulo I Neste capítulo fálase da importancia da acuicultura e a necesidade de desenvolver novos tratamentos para o control de infeccións producidas por bacterias patógenas. Ademais, descríbese de forma xeral o mecanismo de captación de ferro e as vantaxes de empregar proteínas de membrana externa receptoras de sideróforos como vacunas. Preséntase a metodoloxía de clonaje, expresión e purificación das proteínas recombinantes FvtA (receptor do sideróforo vancrobactina producido por Vibrio anguillarum RV22) e FstC (receptor dos sideróforos amonabactinas biosintetizados por Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida VT45). Adicionalmente, expresouse e purifico rFstB (receptor de acinetobactina producido por A. salmonicida subsp. salmonicida VT45). Finalmente, móstranse os resultados obtidos ao ensaiar rFvtA, rFstB e rFstC como vacuna en lenguados infectados con vibriosis e forunculosis. Capítulo II Este capítulo está dedicado á aplicación de sideróforos e nanopartículas magnéticas para o desenvolvemento dun mecanismo de detección de bacterias. Descríbense as aplicacións dos sideróforos en diferentes campos xunto co proceso de deseño de nanomateriales magnéticos e a versatilidad destes para sintetizar conxugados para desenvolver aplicacións. Descríbese a síntese do conxugado entre o sideróforo feroxamina e nanopartículas magnéticas funcionalizadas (MNP@SiO2@NH@Fa), o seu caracterización e a súa capacidade de captura de Yersinia enterocolitica WC-A. Tamén, móstrase a síntese dun análogo de enterobactina que pode ser empregado para a síntese de conxugados. Capítulo III Neste capítulo faise unha breve introdución da importancia dos microorganismos mariños como productores de produtos naturais, a súa actividade biolóxica e o seu gran diversidad estructural. Tamén se expoñerán os métodos máis xerais para a selección de condicións para o cultivo e obtención de compostos producidos por bacterias principalmente. Móstrase o proceso de elucidación estructural do tetrapéptido cereusitin A producido Bacillus cereus RKHC-09 mediante experimentos de resonancia magnética nuclear mono e bidimesionales e análise de espectrometría de masas de baixa e alta resolución. Adicionalmente, determinouse a estereoquímica absoluta por medio do método de Marfey. Finalmente mostrásese o proceso de detección do complexo de Ga(III) de piscibactina no sobrenadante de cultivo de V. anguillarum RV22 e o mutante vabF por medio de cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS).

[Abstract] This Doctoral Thesis is divided into three parts. The first part describes the importance of iron uptake systems in fish pathogenic bacteria and the use of siderophore-receptor proteins as potential vaccine candidates. In the second part, the synthesis of a conjugate of feroxamine siderophore and magnetic nanoparticles is shown as an attempt to create a new surface able to capture Yersinia enterocolitica WC-A. Finally, in chapter III the structural and stereochemical determination of the tetrapeptide cereusitin A is described as well as the detection and identification of the piscibactin-Ga(III) complex in the supernatants of the cultures of Vibrio anguillarum RV22 and its vabF mutant. Furthermore, the piscibactin is shown as an important molecule in the iron uptake system and the virulence of V. aguillarum. Chapter I This chapter discusses the importance of aquaculture and the need to develop new treatments for the control of infections produced by pathogenic bacteria. In addition, the mechanism of iron uptake along with the advantages of using siderophores receptor outer membrane proteins as vaccines candidates is described broadly. Here are presented the methodology of cloning, expression and purification of the recombinant proteins FvtA (receptor of the siderophore vancrobactin produced by Vibrio anguillarum RV22) and FstC (receptor of the siderophores amonabactin biosynthesized by Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida VT45). Additionally, the expression and purification of rFstB protein (acinetobactin receptor produced by A. salmonicida subsp. salmonicida VT45) is shown. Finally, the results obtained when testing rFvtA, rFstB and rFstC as a vaccine in flounders infected with vibriosis and forunculosis are presented. Chapter II This chapter is dedicated to the application of siderophores and magnetic nanoparticles to the study of a bacterial detection mechanism. The applications of siderophores in different fields are described along with the design process of magnetic nanomaterials and its versatility and capability in the conjugate synthesis to develop applications. The synthesis of the conjugate of feroxamine and functionalized magnetic nanoparticles (MNP@SiO2@NH@Fa), its characterization and capture capacity towards Yersinia enterocolitica WC-A are described. Also, the synthesis of an enterobactin analogue that can be used for the synthesis of conjugates is shown. Chapter III In this chapter is made a brief introduction of the importance of marine microorganisms as producers of natural products, their biological activity and their great structural diversity. Also, the most general methods for the selection of culture conditions in the obtainment of compounds mainly produced by bacteria are exposed. The structural elucidation process of the tetrapeptide cereusitin A produced by Bacillus cereus RKHC-09 is shown by mono and bidimensional nuclear magnetic resonance experiments as well as low and high resolution mass spectrometry analysis. Additionally, absolute stereochemistry was determined by means of the Marfey’s method. Finally, here is shown the procedure developed for the detection of piscibactin- Ga(III) complex from culture supernatant of V. anguillarum RV22 and its vabF mutant by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS).