Estabilización y mejora de la producción del metabolito fúngico AD0157, inhibidor de la angiogénesis

Abstract

[Resumen] La Organización Mundial de la Salud (OMS) afirma que el cáncer es una de las principales causas de muerte en el mundo (OMS 2017). La elevada ratio de mortalidad en pacientes con esta enfermedad está asociada al proceso de metástasis del tumor inicial a tejidos distantes. Aunque esta diseminación de células tumorales puede ocurrir por diferentes mecanismos, la mayoría ocurre en procesos de angiogénesis y linfangiogénesis alterados, obteniendo así, acceso al sistema circulatorio (García-Caballero et al. 2017a, Varinska et al. 2017). La angiogénesis es un proceso fisiológico que consiste en la creación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los ya existentes. Está estrictamente controlado por estimuladores e inhibidores, limitado en adultos a procesos relacionados con el ciclo reproductivo y reparación de hueso. Sin embargo, una desregulación continuada de este proceso está relacionada con otras enfermedades no neoplásicas como son las retinopatías proliferativas o diabéticas, psoriasis y artritis entre otras. La angiogénesis está considerada como uno de los principales marcadores del cáncer, donde juega un papel central en el crecimiento y en la metastatización tumoral. Por este motivo, es interesante su estudio como nueva diana terapéutica (García-Caballero et al. 2017b). Recientemente, la FDA (Food and Drugs Administration) aprobó el uso de inhibidores angiogénicos como tratamiento contra el cáncer y otras enfermedades dependientes de la angiogénesis (García-Caballero et al. 2014). La linfangiogénesis es el proceso encargado de la formación de nuevos vasos linfáticos. Estudios clínico-patológicos en micrometástasis, sugieren que los vasos linfáticos son usados como ruta inicial en la invasión tumoral hacia los nódulos linfáticos (LN). La presencia o no de células tumorales en estos nódulos es un marcador diagnóstico importante que ayuda en la predicción del estadío de la enfermedad y en la toma de decisiones terapéuticas. Por lo tanto, la linfangiogénesis representa una diana muy atractiva para la prevención y tratamiento de metástasis linfáticas (García-Caballero et al. 2017a). La mayoría de los fármacos antiangiogénicos y antilinfangiogénicos tienen como diana el eje de señalización del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y su receptor (VEGFR-3/2) por su papel clave tanto en la estimulación y proliferación de células endoteliales vasculares (activación de las rutas PI3K/Akt y MAPK/ERK1-2) como del proceso de linfangiogénesis en situaciones patogénicas (Chiodelli et al. 2017, García-Caballero et al. 2013, 2017a, Varinska et al. 2017). El uso de especies marinas está demostrando ser una fuente hasta ahora desconocida y muy rica en la obtención de productos muy interesantes de aplicación biotecnológica. Se caracterizan por tener estructuras químicas únicas, diferentes modos de acción, muy prometedores en cuanto a actividades biológicas y por presentar perfiles de toxicidad diferentes a los encontrados en especies terrestres (Varinska et al. 2017). El compuesto AD0157, un pirrol (Figura 3) aislado y purificado de caldo de fermentación de un hongo marino Paraconiothyrium sp. HL-78gCHSP3-B005, seleccionado en un proceso de screening primario por sus propiedades angiomoduladoras in vitro, ex vivo e in vivo (García-Caballero et al. 2014). También se describió su actividad inhibitoria frente a la linfangiogénesis (García-Caballero et al. 2017a, 2017b). Su actividad antiangiogénica se debe a la inducción de apoptosis en células endoteliales a través de la condensación de la cromatina, provocando una fragmentación del DNA incrementando la población en SubG1 y activando la ruta de las caspasas (García-Caballero et al. 2014). Todo apunta a que el compuesto AD0157 actúa en las rutas de señalización PI3K/Akt, fundamental en la regulación de la supervivencia, proliferación y migración celular y en el proceso de angiogénesis; y en la ruta MAPK/ERK1-2, controla la proliferación celular. En ambas rutas actúa inhibiendo la fosforilación de Akt y ERK1-2, teniendo mayor efecto en la primera ya que se necesita menor concentración. Cabe destacar la no toxicidad del compuesto (García-Caballero et al. 2014, 2017c). En cuanto al modo de acción en la linfangiogénesis, es un inhibidor dual de VEGRF-3, involucrado en la formación de vasos linfáticos; y VEGRF-2, formación de heterodímeros con VEGRF-3 (García-Caballero et al. 2017a). La problemática para la obtención de este compuesto es doble, por una parte su producción es escasa, y por otra es irregular. Se observó que el hongo marino del que proviene, HL-78gCHSP3-B005, presenta habitualmente sectores dentro de sus colonias con morfologías variables, por lo que se supone que es inestable genéticamente. Los sectores son zonas de la colonia, que surgen como consecuencia de mutaciones a partir de una célula. Puesto que las colonias sobre placa de agar nutritivo presentan crecimiento circular a partir de un inóculo central, cuando una célula muta y esa mutación afecta a su morfología y a de sus descendientes, aparece una zona de morfología distinta, triangular denominada sector (Pitt et al. 2009). Para continuar con las pruebas in vivo es necesario obtener un peso mínimo del compuesto, y actualmente, se desconocen los parámetros críticos que permitan producir el compuesto de manera estandarizada. Los experimentos que se realizaron previamente a este trabajo se centraron en la variabilidad de la cepa, la evaluación del medio de producción y el número de pases de inóculo. La variabilidad de la cepa y de su capacidad de producción se pone de manifiesto en las distintas tandas de selecciones clonales que se realizaron, obteniéndose clones con una buena producción. Sobre estos clones se realizaron pruebas de medios y sólo en el medio AG-12, empleado actualmente, se obtiene producción de AD0157. El número de pases de inóculo quedó establecido en uno. Sin embargo, sucede de forma cíclica que cuando se trabaja con un clon en las condiciones ideales, el compuesto deja de producirse y es necesario iniciar el trabajo de selección clonal de nuevo. Los principales objetivos que se plantean en este trabajo son: 1. Estabilizar la cepa genéticamente, de manera que se pueda solventar el problema de la capacidad de variabilidad extrema del organismo productor. 2. Definir las condiciones de fermentación para obtener una producción mejorada del compuesto AD0157. Para solventar el problema de la variabilidad genética se realizará un aislamiento de clones estables después de realizar un tratamiento químico con benomilo, un compuesto antifúngico haploidizante ampliamente utilizado en estabilización, cuyo principio activo es el metil 1-(butilcarbamoil) bencimidazol-2-il carbamato. Éste se une a la subunidad β de la tubulina, presente en los microtúbulos interfiriendo así, con la división celular, el transporte intracelular y la segregación cromosómica. Estos efectos hacen que las células permanezcan en la etapa metafase de la mitosis y provoca pérdidas cromosómicas con mayor probabilidad (Hastie 1970, Anderson & Yacoob 1984, Blasco et al. 2008). Respecto a la optimización de las condiciones de fermentación, el trabajo se centrará en modificar parámetros que no hayan sido trabajados previamente, centrándose en el tiempo y cantidad de inóculo, y en el tiempo de fermentación, manteniendo constante el medio, la temperatura y la agitación.