Posta a punto dun protocolo de fecundación in vitro de gametos de lapa "Patella depressa"

Abstract

[Resumen] El uso de Patella depressa como organismo test en un bioensayo embrio-larvario para ser utilizado en estudios de calidad ambiental del medio costero, hace necesario la puesta a punto de un protocolo de fecundación in vitro y desarrollo embrionario para esta especie. Para ello, es necesario estandarizar un protocolo, realizando varias pruebas para optimizar parámetros determinantes en la fecundación y el desarrollo embrionario. En este trabajo hemos determinado, el pH y el tiempo óptimo de alcalinización que necesitan los ovocitos para finalizar la maduración previamente a la fecundación in vitro. También hemos estandarizado la concentración de esperma óptima para una fecundación exitosa, ya que una elevada concentración produce poliespermia, dando lugar a larvas anormales. Del mismo modo, hemos determinado la concentración óptima de ovocitos, ya que demasiado elevada agotaría el oxígeno disponible, provocando la mortalidad de los embriones y larvas. Una vez establecidos estos parámetros, hemos utilizado el bioensayo estandarizado para estudiar la toxicidad de los metales pesados, cobre y cadmio, sobre el desarrollo embrionario de Patella depressa, exponiendo los embriones a diferentes concentraciones de estos metales. Hemos concluido que la alcalinización de los ovocitos debe hacerse a pH 9.0 durante 10 minutos. La mejor combinación de concentración esperma/ovocitos para una fecundación exitosa es añadir esperma “sin diluir” a 194.45 ovocitos/mL. Finalmente hemos determinado que el Cu y el Cd reducen un 50% el éxito en el desarrollo embrionario, a partir de 64μg/L y 150μg/L, respectivamente.

[Abstract] The use of Patella depressa as a test organism in an embryo-larval bioassay to be used in studies of environmental quality of the coastal environment, makes necessary to develop a protocol for in vitro fertilization and embryo development for this species. For this, it is necessary to standardize a protocol, by conducting several tests to optimize key parameters in fertilization and embryo development. In this work we determined the optimum pH and time of alkalization to finalize oocyte maturation prior to in vitro fertilization. We have also determined the optimal sperm concentration for successful fertilization, since high concentration produces polyspermy, resulting in abnormal larvae. Likewise, we have determined the optimal concentration of oocytes, since too high concentration decreases the available oxygen, causing the mortality of embryos and larvae. Once these parameters have been determined, we used the standardized protocol to study the toxicity of heavy metals, copper and cadmium, on embryonic development of Patella depressa, by exposing the embryos to different concentrations of these metals. We have concluded that alkalinization of oocytes should be at pH 9.0 for 10minutes. The best combination of concentration sperm/oocytes for successful fertilization is adding sperm undiluted to 194.45oocytes/mL. Finally, we have determined that Cu and Cd reduced 50% of success in embryonic development from concentrations of 64μg/L and 150μg/L, respectively.