Búsqueda de enzimas lipolíticas termófilas y expresión en microorganismos mesófilos

Abstract

[Resumen] El descubrimiento de enzimas lipolfticas con nuevas y/o mejores características es dave para la optimización de biotransformaciones de interés industrial o biotecnológico. Las enzimas termófilas presentan una serie de ventajas como mayor estabilidad frente a altas temperaturas, pH extremos y agentes desnaturalizantes. En este trabajo se estudiaron las enzimas lipolfticas de Thermus thermophilus HB27. Se seleccionaron dos enzimas lipollticas de la secuencia de su genoma y se expresaron en Saccharomyces cerevisiae. Únicamente la esterasa, previamente identificada, se expresó de forma funcional, termo estable y activa a temperaturas mesó filas, ofreciendo mayor rendimiento de producción que la cepa original. También se construyó una geno teca de expresión con el fósmido pCC1FOS, cuyos dones positivos únicamente expresaban dicha esterasa. Alternativamente se buscaron enzimas lipollticas en el manantial termal de Rio Caldo (Ourense 1 mediante metagenómica funcional empleando el fósmido pCC1FOS. En la metagenoteca de un cultivo de enriquecimiento (aceite de oliva como única fuente de carbono l, inoculado con sedimentos, se encontraron más de 100 dones positivos, la mayoría con enzimas lipoHticas del género Geobaci/lus, estudiadas con anterioridad. En la metagenoteca del agua uno de los 6 dones positivos detectados expresaba una nueva esterasa de la familia VIII, con características mesófilas a pesar de su origen termal.

[Resumo] O descubrimento de encimas lipolfticas con novas e/ou mellores caracterfsticas é clave para a optimización das biotransformacións de interese industrial ou biotecnolóxico. As encimas termófilas presentan ademáis unha serie de vantaxes como maior establlIdade fronte a altas temperaturas, pH extremos e axentes desnaturalizan tes. Neste traballo estudáronse as encimas lipolfticas de Thermus thermophilus H827. Seleccionáronse dúas encimas lipolfticas da secuencia do seu xenoma e expresáronse en Saccharomyces cerevisiae. Unicamente a esteraS3, previamente identificada, expreso use de forma funcional, termoestable e activa a temperaturas me5ÓmaS, ofrecendo maior rendemento de producción que a cepa orixinal. Tamén se constru{u una xenoteca de expresión ca fósmido pCCIFOS na que unieamente se encontraron clons positivos que expresaban a devandita esteraS3. Alternativamente buscáronse encimas lipolfticas no manancial termal de Rio Caldo (Ourense) mediante metaxenómica funcional empregando o fósmido PCCIFOS. Na metaxenoteca dun cultivo de enriquecemento (aceite de oliva como única fonte de carbono), inoculado con sedimentos do manancial, atopáronse máis de 100 clons positivos, a maioría con encimas lipoUticas do xénero Geobacillus, estudadas con anterioridade. Na metaxenoteca da mostra de auga encontráronse 6 clons positivos. Un deles expresaba una nova esterasa da familia VIll, con caracterfstlcas mesó filas a pesar da súa orixe.

[Abstract] The discovery of novellipolytic enzymes with new and/or improved features is the key to the optimization of industrial and biotechnological biotransformations. Thermophilic enzymes exhibit advantages such as stability at high temperatures, extreme pH values and denaturing agents. In this work, lipoIytic enzymes from Thermus thermophilus were studied. Two selected lipolytic enzymes were expressed in Saccharomyces cerevisiae. Only the esterase, previously identified, was functionally expressed as a thermostable enzyme wlth activity at mesophilic temperature. The recombinant yeast strain provlded higher production yieIds than T. thermophilus. A genomic library was construeted with pCCIFOS fosmid and two positive lipolytic clones were deteeted. 80th contained the mentioned esterase. Alternatively, lipolytic enzymes were studied In the thermal spring Rio Caldo (Ourense) by functional metagenomic using pCCIFOS fosmid. In the metagenomic library from an enrichment culture (wlth olive oH as sole carbon source), inoculated with sediments from the spring. 140 positives lipolytic clones were detected. Most of them expressed Geobacillus Iipolytic enzymes. In the metagenomic library from water 6 positive clones were detected. One of them expressed a novel esterase from family VIII with mesophillc-like features despite of 115 thermal origino