Identificación de nuevos biomarcadores de la condrogénesis de células madre mesenquimales de pacientes con artrosis mediante técnicas proteómicas
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http://hdl.handle.net/2183/14406Coleccións
- Teses de doutoramento [2167]
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Identificación de nuevos biomarcadores de la condrogénesis de células madre mesenquimales de pacientes con artrosis mediante técnicas proteómicasAutor(es)
Director(es)
Ruiz Romero, CristinaBlanco García, Francisco Javier
Data
2015Centro/Dpto/Entidade
Universidade da Coruña.Departamento de Ciencias de la SaludResumo
[Resumen]La capacidad de diferenciación de las células madre mesenquimales (MSCs) hacia
condrocitos, en un proceso conocido como condrogénesis, concede a estas células
un gran potencial terapéutico para la reparación de los defectos del cartílago
característicos de enfermedades reumáticas como la artrosis. Sin embargo los
mecanismos moleculares que participan en este proceso de diferenciación no son
del todo conocidos. las técnicas proteómicas posibilitan analizar globalmente la
actividad celular, ya que permiten obtener perfiles proteicos que proporcionan
Información sobre las conexiones existentes entre las proteínas y las rutas o
procesos celulares en las que participan. En este trabajo se han empleado
diferentes metodologías proteómicas para estudiar los mecanismos moleculares
que participan en la diferenciación condrogénica de las MSCs obtenidas de
médula ósea, con el fin de identificar nuevos marcadores condrogénicos que
puedan emplearse en la monitorización de terapias celulares encaminadas a la
reparación del cartílago.
Inicialmente se estandarizó el marcaje metabólico SILAC en MSCs aisladas de
médula ósea para llevar a cabo los estudios proteómicos cuantitativos. Una vez
optimizado este método, su aplicación nos permitió describir las proteínas
intracelulares cuya abundancia se altera durante el proceso de diferenciación de
las MSCs. Los niveles de expresión de 65 proteínas se modularon
significativamente entre los dos estadios celulares analizados (indiferenciado (día
2) y diferenciado (día 14)). La mayor parte de estas proteínas estaban
involucradas en el metabolismo celular y en la glucólisis. En base a este trabajo,
decidimos realizar otro estudio en el que aplicamos el doble marcaje SILAC
seguido de un análisis nanolC-ESI-MS para identificar y cuantificar las proteínas
secretadas por las MSCs a los dlas 2 y 14 del proceso condrogénico. Mediante esta
estrategia, se detectaron cambios significativos en la abundancia de 34 proteínas
entre los dos tiempos analizados. la mayor parte de las protelnas aumentadas a
día 14 son proteínas relacionadas con la matriz extracelular del cartílago, y entre
ellas validamos mediante inmunoensayo el incremento de proteoglicano 4 (PRG4)y TIMP1 como potenciales biomarcadores de diferenciación condrogénica.Finalmente, se comprobó la utilidad de las técnicas de imagen mediante
espectrometría de masas (MS Imaging) para la caracterización de lipldos
involucrados en el proceso de diferenciación. En este último estudio demostramos
que las MSCs metabolizan la esfingomielina durante la diferenciación
condrogénica, V que la fosfocolina V sus derivados son posibles marcadores de
indiferenciación de MSCs [Resumo]
A capacidad e de diferenciación das células nai mesenquimais (MSCs) cara os
condrocitos, nun proceso coñecido como condroxénese, outorga a estas célulasFinalmente, se comprobó la utilidad de las técnicas de imagen mediante
espectrometría de masas (MS Imaging) para la caracterización de lipldos
involucrados en el proceso de diferenciación. En este último estudio demostramos
que las MSCs metabolizan la esfingomielina durante la diferenciación
condrogénica, V que la fosfocolina V sus derivados son posibles marcadores de
indiferenciación de MSCs.
un gran potencial terapéutico para a reparación dos defectos da cartilaxe
característicos de enfermidades reumáticas como a artrose. Non obstante, os
mecanismos moleculares que participan neste proceso de diferenciación non son
de todo coñecidos. As técnicas proteómicas posibilitan analizar globalmente a
actividade celular, xa que permiten obter perfís proteicos que proporcionan
información sobre as conexións existentes entre as prote(nas e as rutas ou
,procesos celulares nos que participan. Neste traballo empregáronse diferentes
metodoloxías proteómicas para estudar os mecanismos moleculares que
participan na diferenciación condroxénica das MSCs obtidas da medula ósea, ca
fin de identificar novos marcadores condroxénicos que poidan empregarse na
monitorización de terapias celulares encamiñadas á reparación da cartilaxe .
Inicialmente estandarizouse a marcaxe metabólica SILAC nas MSCs iIIadas de
medula ósea para levar a cabo os estudos proteómicos cuantitativos. Unha vez
optimizado este método, a súa aplicación permitiunos describir as proteínas
intracelulares cuxa abundancia altérase durante o proceso de diferenciación das
MSCs. Os niveis de expresión de 65 proteínas moduláronse significativamente
entre os dous estadios celulares analizados (indiferenciado (dia 2) e diferenciado
(día 14)). A maior parte destas proteínas estaban implicadas no metabolismo
celular e na glucólise. En base a este traballo, decidimos realizar outro estudo no
que aplicamos a doble marcaxe SILAC seguido da análise nanoLC-ESI-MS para
identificar e cuantificar as proteínas secretas palas MSCs ós días 2 e 14 do proceso
de condroxénese. Mediante esta estratexia, detectáronse cambios significativos
na abundancia de 34 proteínas entre os dous tempos analizados. A maior parte
das proteínas aumentadas a día 14 son proteínas relacionadas coa matriz
extracelular da cartilaxe, e entre elas validamos mediante inmunoensaios o
incremento do proteoglicano 4 (PRG4) e TIMPl como potenciais biomarcadores
da diferenciación condroxénica. Finalmente, comprobouse a utilidade das técnicas de imaxen mediante espectrometrla de masas (MS Imaging) para a
caracterización de ¡¡pidos involucrados no proceso de diferenciación. Neste último
estudo demostramos que as MSCs metabolizan a esfingomielina durante a
diferenciación condroxénica, e que a fosfocoJina e os seus derivados son posibles
marcadores de indiferenciación das MSCs. [Abstract]The differentiation capacity of mesenchvmal stem cells (MSCs) towards
chondrocytes, in a process called chondrogenesis, provides them a great
therapeutic potential for the repalr of cartJlage defects in rheumatic diseases such
as osteoarthritis (OA). However, the molecular mechanisms underlving the
chondrogenesis process are still in part unknown. Proteomic tools enable us to
globallv analvze cellular activitv, obtaining proteomic profiles that provide us
information about the present connections between proteins and ceJlular
pathwavs. In this work, we have emploved different proteomic strategies in order
to elucidate the molecular mechanisms involved in the chondrogenesis process of
bone marrow MSCs, with the purpose of identify new chondrogenic markers
useful for molecular monitorization in cell therapv-based approaches for cartllage
repair.
Firstly, we standardized SILAC labeling in bone marrow MSCs in order to carry out
quantitatlve proteomic experiments. Once the SILAC method was optimized, its
application aJlowed us to describe the modulations of intraceJlular proteins during
the chondrogenic differentiation of MSCs. 65 proteins exhibited a significant
modulation of their levels between the two different stages of chondrogenic
differentiation (daV 2 vs. dav 14). Most of these proteins were involved in cellular
metabolism and glvcolvsis. Next, we emploved a double-SILAC strategy, followed
bV nanoLC-ESI·MS analysis, to Identify and quantify the extraceJlular proteins of
M5Cs at davs 2 and 14 of chondrogenesis. Using this methodology, we found
alterations in the abundance of 34 proteins between the two time points
evaluated. Most of the proteins increased at day 14 were cartilage-specific ECM
proteins. Proteoglvcan 4 (PRG4) and TIMP1 were validated bV immunoassavs so
both have a valuable potential use as biomarkers of chondrogenic differentiation.
Flnallv, we confirmed the utilltV of mass spectrometry imaging (MSI) for the
characterization of the lipids involved in chondrogenesis. In this studv, we
confirmed that M5Cs mobilize the sphingomvelin during their differentiation toward chondrocytes and the phosphocholine-related lipids could be markers of
the undifferentiated stage.
Palabras chave
Condrogénesis
Artrosis
Células madre mesenquimatosas
Marcadores biológicos
Artrosis
Células madre mesenquimatosas
Marcadores biológicos
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