Diferenciación condrogénica "in vitro" de biomateriales de fibrina y células madre mesenquimales inmortalizadas

Abstract

[Resumen] Objetivos: 1) Obtener distintas formulaciones combinando células CMMh-3A6 con biomateriales procedentes de PRP o PRFC y 2) estudiar el proceso de condrogénesis de las células CMMh-3A6 en dichas formulaciones. Metodología: las células CMMh-3A6 fueron embebidas o sembradas en biomateriales de PRP o PRFC, que se mantuvieron en cultivo en medio condrogénico o en medio control durante 4, 7, 14 y 21 días. Las tinciones histoquímicas y la expresión relativa de los genes COLI, COLII, SOX9 y ACAN se utilizaron para seleccionar el formato (2D o 3D) y la dosis celular (5·104, 105 y 5·105) más adecuados. Se realizaron tinciones inmunohistoquímicas para angiogenina, CD34 y CD31 y se analizó la expresión de los genes VWF y CDH5 para valorar la diferenciación angiogénica. Finalmente se comparó la actividad celular y el grado de condrogénesis en el biomaterial seleccionado con respecto a un biomaterial cultivado en medio control, un control de condrogénesis 3D en una matriz inerte de agarosa y un control de condrogénesis en monocapa. Resultados: la expresión de COLII, SOX9 y ACAN fue más intensa y sostenida en los biomateriales 3D, en los que las tinciones histoquímicas permitieron ver que las células producían activamente MEC cartilaginosa. La positividad de las tinciones para angiogenina y CD34 y la elevada expresión de VWF demostraron la existencia de angiogénesis en dichos biomateriales. La actividad celular y la condrogénesis fueron similares en los biomateriales de PRP y PRFC, y superiores a las detectadas en los biomateriales cultivados en medio control, los controles 3D de agarosa y los controles en monocapa. La degradación por fibrinólisis fue muy intensa. Conclusiones: los biomateriales 3D de PRP y PRFC son más adecuados que los biomateriales 2D para la diferenciación condrogénica de las células. En ellos se produce una importante fibrinólisis y los FC aportados por el plasma y las plaquetas parecen contribuir a la condrogénesis, aunque también parecen provocar una inducción angiogénica.

[Resumo] Obxectivos: 1) Obter distintas formulacións combinando células CMMh-3A6 con biomateriais procedentes de PRP ou PRFC e 2) estudar o proceso de condroxénese das células CMMh-3A6 en ditas formulacións. Metodoloxía: as células CMMh-3A6 foron embebidas ou sementadas en biomateriais de PRP ou PRFC, que se mantiveron en cultivo en medio condroxénico ou en medio control durante 4, 7, 14 e 21 días. As tinguiduras histoquímicas e a expresión relativa dos xenes COLI, COLII, SOX9 e ACAN utilizáronse para seleccionar o formato (2D ou 3D) e a dose celular (5·104, 105 y 5·105) máis axeitados. Realizáronse tinguiduras inmunohistoquímicas para anxioxenina, CD34 e CD31 e analizouse a expresión dos xenes VWR e CDH5 para valorar a diferenciación anxioxénica. Finalmente comparouse a actividade celular e o grao de condroxénese no biomaterial seleccionado con respecto a un biomaterial cultivado en medio control, un control de condroxénese 3D nunha matriz inerte de agarosa e un control de condroxénese en monocapa. Resultados: a expresión de COLII, SOX9 e ACAN foi máis intensa e sostida nos biomateriais 3D, nos que as tinguiduras histoquímicas permitiron ver que as células producían activamente MEC cartilaxinosa. A positividade das tinguiduras para anxioxenina e CD34 e a elevada expresión de VWF demostraron a existencia de anxioxénese en ditos biomateriais. A actividade celular e a condroxénese foron similares nos biomateriais de PRP e PRFC, e superiores ás detectadas nos biomateriais cultivados en medio control, nos controis 3D de agarosa e nos controis en monocapa. A degradación por fibrinólise foi moi intensa. Conclusións: os biomateriais 3D de PRP e PRFC son máis adecuados que os biomateriais 2D para a diferenciación condroxénica das células. Neles prodúcese unha importante fibrinólise e os FC aportados polo plasma e as plaquetas parecen contribuír á condroxénese, aínda que tamén parecen provocar unha indución anxioxénica.

[Abstract] Objectives: 1) To obtain different formulations combining CMMh-3A6 cells with PRP or PRFC-derived biomaterials and 2) to study CMMh-3A6 cells chondrogenesis in these formulations. Methods: CMMh-3A6 cells were embedded in or seeded on PRP or PRFC biomaterials, which were cultured for 4, 7, 14 and 21 days. Histochemical staining and COLI, COLII, SOX9 and ACAN genes relative expressions were used to select the more suitable format (2D or 3D) and cell dose (5·104, 105 y 5·105). Angiogenin, CD34 and CD31 immunohistochemical staining, as well as VWF and CDH5 gene expression analysis were performed in order to assess angiogenic differentiation. Finally, cell activity and chondrogenesis extent in the selected biomaterials were compared with those of a control media-cultured biomaterial, a chondrogenic 3D, inert, agarose matrix and a chondrogenic monolayer control. Results: 3D biomaterials showed a higher and more sustained COLII, SOX9 and ACAN gene expression and their cells actively produced cartilaginous MEC, as seen using histochemical staining. VWF high expression and angiogenin and CD34 positivities also suggest an incipient angiogenesis in these biomaterials. Cell activity and chondrogenesis were similar in both PRP and PRFC biomaterials, and better than those detected in control-media cultured biomaterials, agarose 3D controls and monolayer controls. Fibrinolysis was very pronounced. Conclusions: 3D PRP and PRFC biomaterials are more suitable than 2D biomaterials for chondrogenic CMMh-3A6 differentiation. They suffer an important fibrinolysis and their plasma and platelet-derived growth factors seem to contribute to chondrogenesis, as well as to induce angiogenesis.