Optimización de las condiciones de cultivo de líneas celulares condrocíticas inmortalizadas

Abstract

[Resumen] La artrosis es una enfermedad heterogénea que afecta a las articulaciones móviles y se caracteriza por estrés celular y degradación de la matriz extracelular (MEC) y del hueso subcondral. Afecta a más de 250 millones de individuos mundialmente y es la principal causa de dolor crónico y limitaciones de movilidad, sobre todo, en personas mayores. Sin embargo, a pesar de todos los avances en investigación, hasta la fecha no existe ningún tratamiento efectivo capaz de curar la artrosis, debido a la falta de conocimiento de la patogénesis de la enfermedad. Existen diferentes tratamientos paliativos e incluso técnicas de terapia celular, pero todavía son incapaces de restaurar el cartílago dañado y devolver la función normal a la articulación. Por tanto, los retos en investigación se centran en estudiar la fisiopatología de la artrosis para encontrar, en última instancia, un tratamiento definitivo. El objetivo de este estudio consistió en optimizar las condiciones de cultivo de una línea inmortalizada de condrocitos artrósicos que se pudiese utilizar como modelo in vitro para estudiar la fisiopatología de la artrosis. Los condrocitos fueron previamente inmortalizados en el laboratorio mediante la transducción del antígeno T grande del virus simio 40 (SV40) y la transcriptasa reversa de la telomerasa humana (hTERT). Estas células se cultivaron y expandieron en monocapa para después cultivarlas en tres dimensiones (3D) formando micromasas en diversos medios de cultivo. Se realizó un análisis histológico, un análisis de la concentración de glucosaminoglicanos (GAGs) y la medición de la expresión de los marcadores de condrocitos primarios [región determinante del sexo del cromosoma Y – caja 9 (SOX9), colágeno tipo II (COL II) y agrecano (ACAN)] mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Estos resultados confirmaron que no se detectó expresión de COL II y ACAN en las micromasas formadas en los medios de diferenciación condrogénica, mientras que sí se detectó expresión de SOX9, un marcador temprano de condrogénesis, en todas las muestras. La conclusión principal de este trabajo es que no se han conseguido determinar correctamente las condiciones de cultivo idóneas de la línea inmortalizada de condrocitos artrósicos que puedan favorecer la expresión de los marcadores típicos de condrocitos primarios, ya que solo se detectó expresión de un marcador de condrocitos.

[Resumo] A artrose é unha enfermidade heteroxénea que afecta ás articulacións móbiles e caracterízase por estrés celular e degradación da matriz extracelular (MEC) e do óso subcondral. Afecta a máis de 250 millóns de individuos en todo o mundo e é a principal causa de dor crónica e limitacións de mobilidade, especialmente en persoas maiores. Non obstante, a pesar de todos os avances na investigación, ata a data non existe un tratamento eficaz capaz de curar a artrose, debido ao descoñecemento da patoxénese da enfermidade. Existen diferentes tratamentos paliativos e incluso técnicas de terapia celular, pero aínda así son incapaces de restaurar a cartilaxe danada e devolver a función normal á articulación. Polo tanto, os retos da investigación céntranse en estudar a fisiopatoloxía da artrose para atopar, en definitiva, un tratamento definitivo. O obxectivo deste estudo foi optimizar as condicións de cultivo dunha liña inmortalizada de condrócitos artrósicos que se poderían empregar como modelo in vitro para estudar a fisiopatoloxía da artrose. Os condrócitos foron inmortalizados previamente no laboratorio polo antíxeno T grande 40 do virus simiano (SV40) e a transcriptase inversa da telomerasa humana (hTERT). Estas células cultiváronse e expandíronse nunha monocapa e despois cultiváronse en tres dimensións (3D) formando micromasa en varios medios. Realizouse unha análise histolóxica, unha análise da concentración de glicosaminoglicanos (GAGs) e a medición da expresión dos marcadores condrocitarios primarios [rexión determinante do sexo do cromosoma Y - caixa 9 (SOX9), coláxeno tipo II (COL II) e aggrecano (ACAN)] por reacción en cadea cuantitativa a tempo real da polimerasa (qPCR). Estes resultados confirmaron que non se detectou ningunha expresión de COL II e ACAN nas micromasas formadas nos medios de diferenciación condroxénicos, mentres que se detectou a expresión de SOX9 , un marcador inicial da condroxénese, en todas as mostras. A principal conclusión deste traballo é que non foi posible determinar correctamente as condicións de cultivo ideais da liña inmortalizada de condrócitos artrósicos que poden favorecer a expresión dos marcadores típicos dos condrócitos primarios, xa que só se detectou unha expresión de marcador.

[Abstract] Osteoarthritis is a heterogeneous illness that affects mobile joints and is characterised by cellular stress and degradation of the extracellular matrix (ECM) and subchondral bone. It affects more than 250 million people worldwide and is the main cause of chronic pain and mobility limitations, especially in older people. Nevertheless, despite the advances in research, nowadays there are not effective treatments capable of treating osteoarthritis, due to the lack of knowledge of its pathogenesis. There are different palliative treatments and even cell therapy techniques, but they are still unable to regenerate damaged cartilage and restore normal function to the joint. Therefore, research challenges focus on studying the pathophysiology of osteoarthritis to find a definitive treatment. The objective of this study was to optimize the culture conditions of an immortalized osteoarthritic chondrocytes line that could be used as an in vitro model to study the pathophysiology of osteoarthritis. Chondrocytes were previously immortalized in the laboratory by the transduction of simian virus 40 large T antigen (SV40) and human telomerase reverse transcriptase (hTERT). We cultured and expanded these cells in a monolayer culture and then cultured them in three dimensions (3D) by forming micromasses in different media. We performed a histological analysis, an analysis of the glycosaminoglycans (GAGs) concentration and the measurement of the expression of primary chondrocyte markers [SRYbox transcription factor 9 (SOX9), type II collagen (COL II) and aggrecan (ACAN)] by real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). These results confirmed that COL II and ACAN were not expressed in the micromasses formed in the chondrogenic differentiation media. On the other hand, we detected the expression of SOX9, an early marker of chondrogenesis, in all samples. The main conclusion of this study is that it has not been possible to correctly determine the ideal culture conditions of the immortalized osteoarthritic chondrocytes line that can benefit the expression of the typical markers of primary chondrocytes, since we could only detect the expression of one marker.