Detección rápida de resistencia bacteriana a antibióticos mediante microscopía de fluorescencia

Abstract

[Resumo] A resistencia bacteriana aos antibióticos é un grave problema de saúde mundial. En situacións críticas, a prescrición rápida do antibiótico axeitado é esencial. Polo tanto, sería de grande interese dispor de procedementos de detección de resistencia que sexan máis rápidos que os antibiogramas estándar, que dependen da avaliación do crecemento bacteriano. Esta tese continúa a liña de exploración, deseño e validación de posibles características fenotípicas-morfolóxicas simples, visibles mediante microscopía de fluorescencia, que permitan a detección rápida e fiable da resistencia a diferentes antibióticos en patóxenos con alto impacto clínico. No caso do cotrimoxazol, en Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae, avaliouse a prevención ou non de alongamento celular inducido por mitomicina C. A prevención ou non da actividade da DNase nos nucleoides bacterianos foi eficaz na caracterización de diferentes antibióticos inhibidores da síntese de proteínas en Staphyloccocus aureus. Finalmente, para a mestura combinada de ciprofloxacino (quinolona) e ampicilina (betalactámico) en E. coli, a sensibilidade/resistencia a cada antibiótico determinouse simultaneamente estimando a condensación ou non do nucleoide (ciprofloxacino) e a presenza ou non de fragmentos de ADN intercelular (ampicilina). Os resultados foron consistentes cos do antibiograma estándar e obtivéronse nun prazo de 60 a 270 minutos.[Resumen] La resistencia bacteriana a los antibióticos es un grave problema sanitario a nivel mundial. En situaciones críticas es importante la prescripción rápida del antibiótico idóneo. Para ello sería de gran interés disponer de procedimientos de detección de resistencias, más rápidos que los antibiogramas estándar, dependientes de la evaluación del crecimiento bacteriano. En esta tesis se continúa la línea de exploración, diseño y validación, de posibles características fenotípicas-morfológicas simples, visibles mediante microscopía de fluorescencia, que permitan la detección rápida y fiable de resistencia a diferentes antibióticos en patógenos de gran impacto clínico. En el caso del cotrimoxazol, en Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae, se evaluó la prevención o no del alargamiento celular inducido por mitomicina C. La afectación o no de la actividad ADNasa sobre los nucleoides bacterianos, fue efectiva para caracterizar diferentes antibióticos inhibidores de la síntesis de proteínas, en Staphyloccocus aureus. Finalmente, para la mezcla conjunta de ciprofloxacino (quinolona) y ampicilina (betalactámico) en E. coli, se logró discriminar simultáneamente la sensibilidad/resistencia a cada antibiótico, estimando la condensación o no del nucleoide (ciprofloxacino) y la presencia o no de fragmentos de ADN intercelular (ampicilina). Los resultados concordaron con los del antibiograma estándar, obteniéndose en tiempos entre 60 y 270 minutos.[Abstract] Bacterial resistance to antibiotics is a serious global health problem. In critical situations, the rapid prescription of the appropriate antibiotic is essential. Therefore, it would be of great interest to have available resistance detection procedures that are faster than standard antibiograms, which depend on the evaluation of bacterial growth. This thesis continues the line of exploration, design, and validation of possible simple phenotypic-morphological characteristics, visible using fluorescence microscopy, that allow for the rapid and reliable detection of resistance to different antibiotics in pathogens with high clinical impact. In the case of cotrimoxazole, in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, the prevention or not of mitomycin C-induced cell elongation, was evaluated. The prevention or not of DNase activity on bacterial nucleoids was effective in characterizing different protein synthesis-inhibiting antibiotics in Staphyloccocus aureus. Finally, for the combined mixture of ciprofloxacin (quinolone) and ampicillin (beta-lactam) in E. coli, sensitivity/resistance to each antibiotic was simultaneously determined by estimating the condensation or not of the nucleoid (ciprofloxacin) and the presence or not of intercellular DNA fragments (ampicillin). The results were consistent with those of the standard antibiogram, and were obtained within 60 to 270 minutes.