Chondrogenic DNA Minicircle-Activated Matrix for Articular Cartilage Repair

Abstract

[Abstract] This doctoral thesis focuses on the development of a gene-activated matrix for cartilage repair by integrating a novel non-viral gene delivery system, a chondrogenic plasmid, a mesenchymal stem cell population (MSCs), and an optimised scaffold. To achieve this, a broad library of niosomes was initially screened as delivery systems of a reporter gene plasmid in immortalised MSCs (iMSCs). Niosomes composed of DOTMA as the cationic lipid, polysorbate 20 (P20) or polysorbate 80 (P80) as the non-ionic surfactant, and either chloroquine (CQ) or cholesterol (CH) as helper lipids, exhibited the highest levels of transgene expression when the surfactant and the helper lipid were formulated at an equimolar ratio. Physicochemical characterization of niosomes and their complexes with DNA (nioplexes) confirmed their suitability for gene delivery applications. Following niosome optimization, two plasmid architectures, a conventional parental plasmid (PP) and a minicircle DNA (MC), were compared to assess their impact on transfection efficiency and gene expression. These constructs encoded the reporter gene GFP and the chondrogenic master regulator SOX9. When delivered via the DP20CQ formulation, both architectures promoted the expression of hyaline-like cartilage markers in a three-dimensional (3D) human MSC (hMSC) aggregate model. Lastly, to better recapitulate the native cartilage microenvironment, a gene-activated matrix was developed by incorporating rat MSCs (rMSCs) and DP20CQ-based nioplexes into a collagen type I/type II and hyaluronic acid (CI/CII-HyA) scaffold. Successful chondrogenic differentiation was verified through the analysis of cartilage-specific molecular markers and extracellular matrix deposition, showing minimal expression of undesired fibrocartilaginous or hypertrophic phenotypes compared to control systems using the commercial reagent Lipofectamine, especially when using the minicircle plasmid. Overall, this work demonstrates that the combination of a CI/CII-HyA scaffold, the DP20CQ niosome delivery system, and an optimised SOX9-containing plasmid architecture constitutes an effective non-viral platform for in situ cartilage repair, enabling localised and sustained gene expression.[Resumen] Esta tesis doctoral se centra en el desarrollo de una matriz activada por genes para la reparación del cartílago mediante la integración de un novedoso sistema no viral de liberación de genes, un plásmido condrogénico, una población de células madre mesenquimales (MSCs) y un andamio optimizado. Para ello, se evaluó inicialmente una amplia biblioteca de niosomas como sistemas de entrega de un plásmido con un gen reportero en células madre mesenquimales inmortalizadas (iMSCs). Los niosomas compuestos por DOTMA como lípido catiónico, polisorbato 20 (P20) o polisorbato 80 (P80) como surfactante no iónico, y cloroquina (CQ) o colesterol (CH) como lípido auxiliar mostraron los niveles más altos de expresión del transgén cuando el surfactante y el lípido auxiliar se formularon en proporciones equimolares. La caracterización fisicoquímica de los niosomas y de sus complejos con ADN (nioplejos) confirmó su idoneidad para aplicaciones de terapia génica. Tras la optimización de los niosomas, se compararon dos arquitecturas plasmídicas, un plásmido parental convencional (PP) y un ADN minicircular (MC), con el fin de evaluar su impacto en la eficiencia de transfección y en la expresión génica. Estas construcciones codificaban el gen reportero GFP y el regulador maestro de la condrogénesis SOX9. Cuando fueron administradas mediante la formulación DP20CQ, ambas arquitecturas promovieron con éxito la expresión de marcadores de cartílago tipo hialino en un modelo tridimensional (3D) de agregados de MSCs humanas (hMSCs). Por último, con el objetivo de reproducir de manera más fiel el microambiente nativo del cartílago, se desarrolló una matriz activada por genes incorporando MSCs de rata (rMSCs) y nioplejos basados en DP20CQ en un andamio compuesto por colágeno tipo I/tipo II y ácido hialurónico (CI/CII-HyA). El éxito de la diferenciación condrogénica se verificó mediante el análisis de marcadores moleculares específicos de cartílago y la deposición de matriz extracelular, mostrando una expresión mínima de fenotipos fibrocartilaginosos o hipertróficos no deseados en comparación con sistemas control que empleaban el reactivo comercial Lipofectamina, especialmente cuando se utilizó el plásmido minicircular. En conjunto, este trabajo demuestra que la combinación de un andamio CI/CII-HyA, un sistema de entrega basado en niosomas DP20CQ y una arquitectura plasmídica optimizada conteniendo el gen SOX9 constituye una plataforma no viral eficaz para la reparación in situ del cartílago, permitiendo una expresión génica localizada y sostenida.[Resumo] Esta tese doutoral céntrase no desenvolvemento dunha matriz activada por xenes para a reparación da cartilaxe mediante a integración dun novo sistema non viral de liberación de xenes, un plásmido condroxénico, unha poboación de células nai mesenquimais (MSCs) e un andamio optimizado. Para iso, avaliouse inicialmente unha ampla biblioteca de niosomas como sistemas de entrega dun plásmido cun xene reporteiro en células nai mesenquimais inmortalizadas (iMSCs). Os niosomas compostos por DOTMA como lípido catiónico, polisorbato 20 (P20) ou polisorbato 80 (P80) como surfactante non iónico, e cloroquina (CQ) ou colesterol (CH) como lípido auxiliar mostraron os niveis máis elevados de expresión do transxene cando o surfactante e o lípido auxiliar formuláronse en proporcións equimolares. A caracterización fisicoquímica dos niosomas e dos seus complexos con ADN (nioplexes) confirmou a súa idoneidade para aplicacións de terapia xénica. Tras a optimización dos niosomas, comparáronse dúas arquitecturas plasmídicas, un plásmido parental convencional (PP) e un ADN minicircular (MC), co fin de avaliar o seu impacto na eficiencia de transfección e na expresión xénica. Estas construcións codificaban o xene reporteiro GFP e o regulador mestre da condroxénese SOX9. Cando foron administradas mediante a formulación DP20CQ, ambas arquitecturas promoveron con éxito a expresión de marcadores de cartilaxe tipo hialina nun modelo tridimensional (3D) de agregados de MSCs humanas (hMSCs). Por último, co obxectivo de reproducir de maneira máis fiel o microambiente nativo da cartilaxe, desenvolveuse unha matriz activada por xenes incorporando MSCs de rato (rMSCs) e nioplexes baseados en DP20CQ nun andamio composto por coláxeno tipo I/tipo II e ácido hialurónico (CI/CII-HyA). O éxito da diferenciación condroxénica verificouse mediante a análise de marcadores moleculares específicos de cartilaxe e a deposición de matriz extracelular, mostrando unha expresión mínima de fenotipos fibrocartilaxinosos ou hipertróficos non desexados en comparación cos sistemas control que empregaban o reactivo comercial Lipofectamina, especialmente cando se utilizou o plásmido mincircular. En conxunto, este traballo demostra que a combinación dun andamio CI/CII-HyA, o sistema de entrega baseado en niosomas DP20CQ e unha arquitectura plasmídica optimizada contendo o xene SOX9, constitúe unha plataforma non viral eficaz para a reparación in situ da cartilaxe, permitindo unha expresión xénica localizada e sostida.