Búsqueda de nuevas termoenzimas en fuentes geotermales gallegas para la síntesis de prebióticos a partir de la paja de trigo

Abstract

[Resumen] El objetivo de la presente tesis consistió en la búsqueda y estudio de nuevas termoenzimas, endo-xilanasas y β-xilosidasas, para desarrollar un proceso biotecnológico para convertir la paja de trigo en productos de alto valor añadido derivados de la fracción hemicelulósica con interesantes aplicaciones en la industria alimentaria como son los prebióticos XOS (xilooligosacáridos). La búsqueda de estas nuevas termoenzimas se hizo a partir de cultivos de enriquecimiento de muestras de aguas del manantial termal de As Burgas (Ourense), con una temperatura de 67 °C, y del manantial geotermal de Río Caldo, también en la provincia de Ourense, con una temperatura de más de 77 °C, en presencia de paja de trigo. La secuenciación del gen ARNr 16S del ADN metagenómico obtenido de los cultivos de enriquecimiento permitió observar la diversidad taxonómica de las distintas muestras, en las cuales hay una amplia variedad de géneros bacterianos, predominando Thermobaculum, Pseudomonas, Kallotenue, Geobacillus y Rhodothermus. Sin embargo, el estudio taxonómico de las cepas silvestres aisladas mostró una baja biodiversidad, lo que limitó la posibilidad de descubrir enzimas novedosas. En consecuencia, la búsqueda de enzimas de interés se realizó utilizando paja de trigo pretratada, empleando dos métodos. Por una parte, se buscó actividad enzimática en cepas silvestres aisladas a partir de estos cultivos de enriquecimiento, encontrándose una enzima con actividad β-xilosidasa denominada CC6.5. Su alta termoestabilidad a 60 °C durante 24 h la hace muy interesante para usarla en procesos industriales que presenten periodos largos de tiempo de incubación a dicha temperatura. Por otra parte, se elaboró una librería metagenómica basada en plásmidos para la búsqueda de enzimas en la cual se encontró una endo-xilanasa denominada CG1C4.6 que se caracteriza por su pequeño tamaño haciéndola muy interesante para su uso en la degradación de sustratos lignocelulósicos. Además, la β-xilosidasa denominada CC6.5 fue expresada en Saccharomices cerevisiae debido a que esta especie es considerada como segura para su uso en la industria alimentaria humana y animal. También se expresó en S. cerevisiae la endo-xilanasa XynA3, enzima expresada y caracterizada previamente por miembros del grupo de investigación en E. coli. Finalmente, con el objetivo de analizar los productos de hidrólisis obtenidos tras tratar la paja de trigo pretratada con las enzimas CC6.5 y XynA3, expresadas en levaduras, y evaluar su estudio sinérgico, se obtuvieron resultados interesantes para su uso en la industria alimentaria ya que se producen XOS de bajo peso molecular con una alta actividad prebiótica.[Resumo] O obxectivo da presente tese consistiu na procura e estudo de novas termoenzimas, endo-xilanasas e β-xilosidasas, para desenvolver un proceso biotecnolóxico para converter a palla de trigo en produtos de alto valor engadido derivados da fracción hemicelulósica con interesantes aplicacións na industria alimentaria como son os prebióticos XOS (xilooligosacáridos). A procura destas novas termoenzimas fíxose a partir de cultivos de enriquecemento de mostras de augas do manancial termal de As Burgas (Ourense), cunha temperatura de 67 °C, e do manancial xeotermal de Río Caldo, tamén na provincia de Ourense, cunha temperatura de máis de 77 °C, en presenza de palla de trigo. A secuenciación do xene ARNr 16S do ADN metaxenómico obtido dos cultivos de enriquecemento permitiu observar a diversidade taxonómica das distintas mostras, nas cales hai unha ampla variedade de xéneros bacterianos, predominando Thermobaculum, Pseudomonas, Kallotenue, Geobacillus e Rhodothermus. Con todo, o estudo taxonómico das cepas silvestres illadas mostrou unha baixa biodiversidade, o que limitou a posibilidade de descubrir encimas novas. En consecuencia, a procura de encimas de interese realizouse utilizando nos cultivos de enriquecemento palla de trigo pretratada, empregando dous métodos. Por unha banda, buscouse actividade encimática en cepas silvestres illadas a partir destes cultivos de enriquecemento atopándose unha encima con actividade β-xilosidasa denominada CC6.5. A súa alta termoestabilidad a 60 °C durante 24 h faiana moi interesante para usala en procesos industriais que presenten períodos longos de tempo de incubación á devandita temperatura. Por outra banda, elaborouse unha librería metaxenómica baseada en plásmidos para a procura de encimas na cal se atopou unha endo-xilanasa denominada CG1C4.6 que se caracteriza polo seu pequeno tamaño facéndoa moi interesante para o seu uso na degradación de substratos lignocelulósicos. Ademais, a β-xilosidasa denominada CC6.5 foi expresada en Saccharomices cerevisiae debido a que esta especie é considerada como segura para o seu uso na industria alimentaria humana e animal. Tamén se expresou en S. cerevisiae a endo-xilanasa XynA3, encima expresada e caracterizada previamente por membros do grupo de investigación en Escherichia coli. Finalmente, co obxectivo de analizar os produtos de hidrólise obtidos tras tratar a palla de trigo pretratada coas encimas CC6.5 e XynA3, expresadas en fermentos, e avaliar o seu estudo sinérxico, obtivéronse resultados interesantes para o seu uso na industria alimentaria xa que se producen XOS de baixo peso molecular cunha alta actividade prebiótica.[Abstract] The aim of the present thesis was the search and study of new thermoenzymes, endo-xylanases and β-xylosidases, to develop a biotechnological process to convert wheat straw into high added value products derived from the hemicellulosic fraction with interesting applications in the food industry such as XOS (xylooligosaccharides) prebiotics. The search for these new thermoenzymes was made from enrichment cultures of water samples from the thermal spring of As Burgas (Ourense), with a temperature of 67 °C, and from the geothermal spring of Río Caldo, also in the province of Ourense, with a temperature of more than 77 °C, in the presence of wheat straw. The 16S rRNA gene sequencing of the metagenomic DNA obtained from the enrichment cultures allowed us to observe the taxonomic diversity of the different samples, in which there is a wide variety of bacterial genera, predominantly Thermobaculum, Pseudomonas, Kallotenue, Geobacillus and Rhodothermus. However, the taxonomic study of the isolated wild strains showed a low biodiversity, which limited the possibility of discovering novel enzymes. Consequently, the search for enzymes of interest was carried out using pre-treated wheat straw in the enrichment cultures, employing two methods. On the one hand, enzymatic activity was sought in wild strains isolated from these enrichment cultures, finding an enzyme with β-xylosidase activity called CC6.5. Its high thermostability at 60 °C for 24 h makes it very interesting for use in industrial processes that require long incubation periods at this temperature. On the other hand, a plasmid-based metagenomic library was elaborated to search for enzymes in which an endo-xylanase called CG1C4.6 was found, which is characterised by its small size, making it very interesting for use in the degradation of lignocellulosic substrates. In addition, the β-xylosidase CC6.5 was expressed in Saccharomices cerevisiae because this species is considered safe for use in the food and feed industry. Endo-xylanase XynA3, an enzyme previously expressed and characterised by members of the research group in Escherichia coli, was also expressed in S. cerevisiae. Finally, in order to analyse the hydrolysis products obtained after treating pre-treated wheat straw with CC6.5 and XynA3 enzymes, expressed in yeast, and to evaluate their synergistic study, interesting results were obtained for their use in the food industry, since low molecular weight XOS with high prebiotic activity are produced.