Deciphering the Role of Hakai in M⁶a Epitranscriptomic Regulation in Colon Cancer

Abstract

[Resumen] Hakai, una E3 ubiquitina-ligasa conocida por inducir la degradación de E-cadherina durante la transición epitelio-mesénquima (EMT), ha sido recientemente implicada en funciones no canónicas al ser identificada como parte del complejo escritor de m⁶A. La N6-metiladenosina (m⁶A) es la modificación más abundante del ARN mensajero en eucariotas y regula procesos clave del metabolismo del ARN, con implicaciones en el microambiente tumoral y la respuesta inmune. Este estudio analiza el papel de Hakai en cáncer de colon, con énfasis en su función epitranscriptómica. Hakai regula la metilación m⁶A independientemente de su actividad como E3 ubiquitina-ligasa. Experimentos de co-inmunoprecipitación y fraccionamiento celular mostraron que Hakai interactúa con VIRMA y controla la localización nuclear de METTL3, estabilizando el complejo de metilación. Además, mediante ensayos de MeRIP se observó que el silenciamiento de Hakai altera la metilación de transcritos inmunorrelacionados, modulando sus niveles de ARNm y proteína. Funcionalmente, el medio condicionado de células de cáncer de colon con Hakai silenciado promovió una mayor respuesta citotóxica en PBMCs y LPMCs, implicando a esta proteína en la modulación del microambiente tumoral. En conjunto, estos hallazgos destacan a Hakai como un novedoso regulador epitranscriptómico e inmunomodulador en cáncer de colon.[Abstract] Hakai, a known E3 ubiquitin-ligase involved in E-cadherin degradation during epithelialmesenchymal transition (EMT), has recently been identified as a component of the m⁶A writer complex, suggesting non-canonical functions beyond protein ubiquitination. N6- methyladenosine (m⁶A) is the most abundant mRNA modification in eukaryotes, playing essential roles in RNA metabolism and gene expression regulation, affecting the tumour microenvironment and immune response modulation. This study investigates Hakai’s role in colon cancer focusing on its epitranscriptomic function in m⁶A regulation. Experimental data demonstrate that Hakai modulates m⁶A dynamics independently of its E3 ubiquitin-ligase activity. Specifically, co-immunoprecipitation and subcellular fractionation revealed that Hakai interacts with VIRMA and regulates the nuclear localiza>on of METTL3, contributing to m⁶A complex stabilization. MeRIP-sequencing further showed that Hakai silencing alters m⁶A methylation of immune-related transcripts, affecting their mRNA and protein levels. Functionally, conditioned medium from Hakai-silenced colon cancer cells enhanced the cytotoxic response of PBMCs and LPMCs, indicating a role in shaping the tumour immune microenvironment. These findings identify Hakai as a novel modulator of m⁶A RNA methylation and immune regulator in colon cancer, underscoring its dual role as an immunomodulator and epitranscriptomic regulatorResumo Hakai, unha E3 ubiquitina-ligasa coñecida por inducir a degradación da E-cadherina durante a transición epitelio-mesénquima (EMT), foi recentemente implicada en funcións non canónicas ao ser identificada como parte do complexo escritor de m⁶A. A N6-metiladenosina (m⁶A) é a modificación máis abundante do ARN mensaxeiro en eucariotas e regula procesos clave do metabolismo do ARN, con implicacións no microambiente tumoral e na resposta inmune. Este estudo analiza o papel de Hakai no cancro de colon, con énfase na súa función epitranscriptómica. Hakai regula a metilación m⁶A independentemente da súa actividade como E3 ubiquitina-ligasa. Experimentos de co-inmunoprecipitación e fraccionamento celular demostraron que Hakai interactúa con VIRMA e controla a localización nuclear de METTL3, estabilizando o complexo de metilación. Ademais, mediante ensaios MeRIP observouse que o silenciamento de Hakai altera a metilación de transcritos relacionados coa inmunidade, modulando os seus niveis de ARNm e proteínas. Funcionalmente, o medio condicionado de células de cancro de colon con Hakai silenciado promoveu unha maior resposta citotóxica en PBMCs e LPMCs, implicando esta proteína na modulación do microambiente tumoral. En conxunto, estes achados destacan a Hakai como un novo regulador epitranscriptómico e inmunomodulador no cancro de colon.