Combination of Gene Therapy With Biomaterials for the Repair of Chondral Lesions

Abstract

[Abstract] Degenerative diseases, such as osteoarthritis, pose a major healthcare issue. This condition, challenged by the limited self-repair of articular cartilage due to its avascular and aneural nature, makes the creation of new and effective treatments for injuries essential. In this scenario, gene therapy, using therapeutic gene transfer for tissue regeneration, offers promise. Non-viral vectors are a safer gene delivery method than viral ones, avoiding immunogenicity and insertional mutagenesis; however, their efficiency is hindered by several biological barriers. Therefore, gene-activated matrices have emerged as a promising tool to address this problem by providing controlled, localized gene delivery, enhancing non-viral vector efficacy for cartilage repair. This thesis explores a novel gene-activated matrix platform combining nonviral gene delivery with biomaterial scaffolds to improve cartilage regeneration. The study first designed and synthesized modified polyethyleneimine (PEI)- based non-viral vectors for efficient mesenchymal stem cell (MSC) transfection. PEI functionalized with particular aldehydes (cationic and hydrophobic) resulted in a specific formulation of polyplexes with higher transfection and cell viability capacity compared to unmodified PEI. MSCs were then transfected with SOX9, a key chondrogenic factor, using the new formulation to promote their chondrogenic differentiation as evidenced by the upregulation of chondrogenic genes and increased proteoglycan production. The internalization of the developed system in MSCs primarily occurred via caveolae-mediated endocytosis. Finally, gene-activated matrices were produced by incorporating the newly generated polyplexes and MSCs into alginate-chitosan scaffolds. Resulting scaffolds exhibited high porosity and supported cell adhesion. Moreover, these constructs released the DNA in a sustained manner and effectively promoted the transfection and chondrogenesis of MSCs in vitro, ex vivo, and in vivo. In summary, this research demonstrates the potential of combining PEIbased gene delivery with alginate-chitosan scaffolds for cartilage tissue engineering, concluding that these engineered gene-activated matrices are promising tools for enhancing cartilage repair and regeneration.[Resumen] Las enfermedades degenerativas, como la osteoartritis, representan un importante desafío para la atención sanitaria. Esta afección, dificultada por la limitada capacidad de autorreparación del cartílago articular debido a su naturaleza avascular y aneural, hace que la creación de tratamientos nuevos y eficaces para las lesiones sea esencial. En este escenario, la terapia génica, que utiliza la transferencia de genes terapéuticos para la regeneración de tejidos, es una solución a tener en cuenta. Los vectores no virales son un método de administración de genes más seguro que los virales, ya que evitan la inmunogenicidad y la mutagénesis insercional, pero presentan menor eficiencia debido a barreras biológicas. Por lo tanto, las matrices activadas por genes han surgido como una herramienta prometedora para abordar este problema al proporcionar una administración de genes controlada y localizada, mejorando la eficacia de los vectores no virales para la reparación del cartílago. Esta tesis explora el diseño de una novedosa plataforma de matriz activada por genes que combina la administración de genes no virales con andamios de biomateriales para mejorar la regeneración del cartílago. En primer lugar, el estudio se centró en el diseño y la síntesis de nuevos vectores no virales basados en polietilenimina (PEI) modificada para una transfección eficiente de células madre mesenquimales (MSC). La PEI funcionalizada con aldehídos concretos (catiónicos e hidrofóbicos) dio como resultado una formulación específica de poliplejos con mayor capacidad de transfección y viabilidad celular en comparación con la PEI no modificada. Posteriormente, se transfectaron las MSC con el factor condrogénico SOX9, utilizando la nueva formulación de PEI funcionalizada llevando a una regulación al alza de genes condrogénicos y a un aumento del depósito de proteoglicanos. La internalización del sistema desarrollado en las MSC ocurrió principalmente a través de la endocitosis mediada por caveolina. Finalmente, se produjeron matrices activadas por genes incorporando los poliplejos recién generados y las MSC en andamios de alginato-quitosano, los cuales exhibieron alta porosidad y soportaron la adhesión celular. Estos andamios liberaron el ADN de manera sostenida y promovieron eficazmente la transfección y la condrogénesis de las MSC in vitro, ex vivo e in vivo. En resumen, esta investigación demuestra el potencial de combinar la administración de genes basada en PEI con andamios de alginato-quitosano para la ingeniería de tejidos cartilaginosos, concluyendo que estas matrices activadas por genes son herramientas prometedoras para mejorar la reparación y regeneración del cartílago.[Resumo] As enfermidades dexenerativas, como a osteoartrite, representan un importante desafío para a atención sanitaria. Esta afección, dificultada pola limitada capacidade de autorreparación da cartilaxe articular debido á súa natureza avascular e aneural, fai que a creación de tratamentos novos e eficaces para as lesións sexa esencial. Neste escenario, a terapia xénica, que utiliza a transferencia de xenes terapéuticos para a rexeneración de tecidos, é unha solución a ter en conta. Os vectores non virais son un método de administración de xenes máis seguro que os virais, xa que evitan a inmunoxenicidade e a mutaxénese insercional, pero presentan menor eficiencia debido a barreiras biolóxicas. Polo tanto, as matrices activadas por xenes xurdiron como unha ferramenta prometedora para abordar este problema ao proporcionar unha administración de xenes controlada e localizada, mellorando a eficacia dos vectores non virais para a reparación da cartilaxe. Esta tese explora o deseño dunha novedosa plataforma de matriz activada por xenes que combina a administración de xenes non virais con andamiaxes de biomateriais para mellorar a rexeneración da cartilaxe. En primeiro lugar, o estudo centrouse no deseño e a síntese de novos vectores non virais baseados en polietilenimina (PEI) modificada para unha transfección eficiente de células nai mesenquimais (MSC). A PEI funcionalizada con aldehídos concretos (catiónicos e hidrofóbicos) deu como resultado unha formulación específica de poliplexos con maior capacidade de transfección e viabilidade celular en comparación coa PEI non modificada. Posteriormente, transfectáronse as MSC co factor condroxénico SOX9, utilizando a nova formulación de PEI funcionalizada, o que levou a unha regulación á alza de xenes condroxénicos e a un aumento do depósito de proteoglicanos. A internalización do sistema desenvolvido nas MSC ocorreu principalmente a través da endocitose mediada por caveolina. Finalmente, producíronse matrices activadas por xenes incorporando os poliplexos recentemente xerados e as MSC en andamiaxes de alginato-quitosano, os cales exhibiron alta porosidade e soportaron a adhesión celular. Estes constructos liberaron o ADN de maneira sostida e promoveron eficazmente a transfección e a condroxénese das MSC in vitro, ex vivo e in vivo. En resumo, esta investigación demostra o potencial de combinar a administración de xenes baseada en PEI con andamiaxes de alginato-quitosano para a enxeñaría de tecidos cartilaxinosos, concluíndo que estas matrices activadas por xenes son ferramentas prometedoras para mellorar a reparación e rexeneración da cartilaxe