Nuevos métodos proteómicos basados en ultrasonidos y espectrometría de masas para la búsqueda de biomarcadores en enfermedades reumáticas

Abstract

[Resumen] La artrosis es la enfermedad articular más frecuente, está caracterizada por la degradación del cartílago articular y crea dolor, rigidez e incapacidad funcional. A pesar de su elevada prevalencia, los métodos diagnósticos actualmente disponibles son limitados y poco sensibles. Se basan en la descripción subjetiva de los síntomas del paciente, en la rigidez articular y en las pruebas radiológicas. Estas limitaciones conllevan, generalmente, a un primer diagnóstico cuando ya se han producido daños en el cartílago. Para evitar llegar a este daño irreversible de la articulación, la investigación en este campo se está centrando en la búsqueda de marcadores biológicos que faciliten el diagnóstico temprano de la enfermedad. El objetivo de esta tesis fue desarrollar tecnologías proteómicas para la búsqueda de biomarcadores proteicos que mejoren el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la artrosis. Nuestra investigación se focalizó en el desarrollo de metodologías rápidas y económicas para buscar biomarcadores en suero mediante espectrometría de masas. Inicialmente se realizaron diversos experimentos para encontrar un nuevo método de depleción de proteínas abundantes del suero. Para ello se comenzó con un estudio comparativo de varias metodologías ya existentes para deplecionar proteínas mediante precipitaciones químicas y kits comerciales. A continuación se desarrolló un nuevo método de depleción basado en el estudio anterior, consistente en dos precipitaciones químicas secuenciales. Para concluir este estudio, se comprobó la utilidad del método de depleción secuencial en la búsqueda de biomarcadores de artrosis en sueros de pacientes artrósicos de grado IV y en sueros de donantes control, mediante la técnica de electroforesis bidimensional diferencial en gel (2D-DIGE). Se identificaron 16 proteínas moduladas en artrosis con respecto a los controles mediante espectrometría de masas, y se realizó la validación de una de ellas mediante inmunodetección. Con la finalidad de simplificar los espectros de masas y mejorar las identificaciones de las proteínas, se realizó otro estudio para aplicar los ultrasonidos indirectos de alta eficacia con tripsina inmovilizada en la digestión de las proteínas. Los resultados obtenidos demostraron que los ultrasonidos indirectos no favorecen la homogenización del enzima en la muestra, con lo que la digestión resultó menos eficaz que con el enzima en solución. Por último, en base a los anteriores estudios, se desarrolló un nuevo método rápido de búsqueda de marcadores peptídicos en suero. El método consistió en un primer paso de depleción secuencial, seguido de la digestión proteica con tripsina en solución acelerada por ultrasonidos indirectos. A continuación se realizó una separación de los péptidos mediante extracción en fase sólida con octadecilo (C18) inmovilizado, y por último se analizaron los péptidos por espectrometría de masas. Esta metodología se aplicó a muestras de pacientes con enfermedades reumáticas (artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica) y donantes control. Los resultados obtenidos proporcionaron un perfil peptídico capaz de clasificar los sueros en las cuatro condiciones estudiadas.

[Resumo] A artrose é a enfermidade articular máis frecuente, está caracterizada pola degradación da cartilaxe articular creando dor, rixidez e incapacidade funcional. Malia a súa elevada prevalencia, os métodos diagnósticos actualmente dispoñibles son limitados e pouco sensibles. Baséanse na descrición subxectiva dos síntomas do paciente, na rixidez articular e nas probas radiolóxicas. Estas limitacións implican, xeralmente, un primeiro diagnóstico cando xa se produciron danos na cartilaxe. Para evitar chegar a este dano irreversible da articulación, a investigación neste campo estase focalizando na procura de marcadores biolóxicos que faciliten o diagnóstico prematuro da enfermidade. O obxectivo desta tese foi desenvolver tecnoloxías proteómicas para a procura de biomarcadores proteicos que melloren o diagnóstico, prognóstico e tratamento da artrose. A nosa investigación focalizouse no desenvolvemento de metodoloxías rápidas e económicas para buscar biomarcadores en soro mediante espectrometría de masas. Inicialmente realizáronse diversos experimentos para atopar un novo método de depleción de proteínas abundantes do soro. Para iso comezouse cun estudo comparativo de varias metodoloxías xa existentes para deplecionar proteínas mediante precipitacións químicas e kits comerciais. A continuación desenvolveuse un novo método de depleción baseado no estudo anterior, consistente en dúas precipitacións químicas secuenciais. Para concluír este estudo, comprobouse a utilidade do método de depleción secuencial na procura de biomarcadores de artrose en soros de pacientes con artrose de grado IV e en soros de doantes control, mediante a técnica de electroforese bidimensional diferencial en xel (2DDIGE). Identificáronse 16 proteínas moduladas en artrose con respecto aos controis mediante espectrometría de masas, e realizouse a validación dunha delas mediante inmunodetección. Coa finalidade de simplificar os espectros de masas e mellorar as identificacións das proteínas, realizouse outro estudo para aplicar os ultrasóns indirectos de alta eficacia con tripsina inmobilizada na dixestión das proteínas. Os resultados obtidos demostraron que os ultrasóns indirectos non favorecen a homoxeneización do enzima na mostra, co que a dixestión resultou menos eficaz que co enzima en solución. Para rematar, en base aos anteriores estudos, desenvolveuse un novo método rápido de procura de marcadores peptídicos en soro. O método consistiu nun primeiro paso de depleción secuencial, seguido da dixestión proteica con tripsina en solución acelerada por ultrasóns indirectos, a continuación realizouse unha separación dos péptidos mediante extracción en fase sólida con octadecilo (C18) inmobilizado e para rematar analizáronse os péptidos por espectrometría de masas. Esta metodoloxía aplicouse a mostras de pacientes con enfermidades reumáticas (artrose, artrite reumatoide e artrite psoriásica) e de doantes control. Os resultados obtidos proporcionaron un perfil peptídico capaz de clasificar os soros nas catro condicions estudadas.

[Abstract] Osteoarthritis (OA) is the most common articular disease characterized by cartilage degradation, pain, stiffness and loss of function. Despite its high prevalence, the diagnostic methods currently available are limited and lack sensitivity. Nowadays, the diagnosis of OA relies on the subjective description of pain symptoms, stiffness in the affected joints, and radiography. For this reason, in most cases an extensive deterioration of cartilage already exists at the time of diagnosis. To avoid the limitations of conventional tests, there is an increasing interest in identifying new specific biological markers for early OA diagnosis. The aim of this work was the development of new proteomics strategies for the discovery of protein biomarkers to improve OA diagnosis, prognosis and treatment. Our research has been focused on the generation of fast and cheap methodologies to find biomarkers of rheumatic diseases in serum samples by mass spectrometry (MS) analysis. Firstly, several experiments were performed to seek a new depletion method for abundant proteins in serum samples. A comparative study of existing depletion methodologies (both chemicals and commercial kits) was performed in order to develop a new depletion method based on these previous results. To conclude this study, we verified the utility of the sequential depletion method in the search of OA biomarkers in serum samples obtained from IV grade OA patients and controls, using the two dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technique. 16 differentially expressed proteins were identified in OA samples compared to controls, and one of them was validated by immunodetection. The indirect high intensity ultrasonic energy (IHI-UE) using immobilized trypsin was applied in order to simplify the mass spectra and improve the protein identification. The results showed that protein digestion with the immobilized trypsin was less effective compared to in-solution digestion after application of IHI-UE. Finally, and according to the previous studies, a new fast method to search peptide markers in serum samples was developed. This method consisted of a sequential depletion step followed by in-solution protein digestion with trypsin using IHI-UE. Then, the resulting peptides were separated by solid phase extraction and analyzed by MS. Samples from controls and patients affected by rheumatic pathologies (osteoarthritis, rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis) were analyzed by this methodology. The results obtained provided different peptidic profiles of the pathologies, which allowed us to classify them according to these profiles.