Characterisation Of IncRNAs and Extracellular Vesicles From Plasma As Biomarkers in Ovarian Cancer

Abstract

[Abstract] Ovarian cancer (OC) is one of the gynaecological malignancies with the highest mortality rates, mainly due to the lack of reliable biomarkers that enable early detection and effective therapeutic options. In this context, this doctoral thesis aimed to investigate novel biomarkers in plasma samples and their functional relevance, exploring their poten􀆟al use in liquid biopsy for the diagnosis, prognosis and monitoring of the disease. Plasma levels of HMGB1 and HMGB2 were determined by ELISA assays; however, as no significant differences were detected between samples from patients and healthy women (controls), their potential use as biomarkers was ruled out. Analysis of the expression of a selected panel of lncRNAs, previously identified as dysregulated through bioinformatic approaches, revealed seven lncRNAs: EPB41L4A-AS1, MIR22, MIR100HG, ERVK13-1, UCA1, SPINT1-AS1 and ZNF232-AS1, that were significantly upregulated in early-stage disease compared with control samples, indicating their potential utility as biomarkers for early detection. In advanced stages, MAGI2-AS3 and ZNF232-AS1 also showed positive regulation, which was additionally associated with the most frequent histotype, high-grade serous carcinoma, whereas MIR100HG exhibited downregulation. In parallel, functinal studies were carried out in ovarian cancer cell lines through the generation of stable knockdown models of SPINT1-AS1 and ZNF232-AS1, allowing the assessment of their involvement in cell proliferation, migration and invasion, three classical hallmarks of tumour progression. The isolation of plasma-derived extracellular vesicles (EVs) using different methodologies demonstrated that differential ultracentrifugation (dUC) and sizeexclusion chromatography (SEC) were both suitable and complementary approaches. A total of 60 proteins, common to both methods, were identified as differentially expressed between EVs derived from pa􀆟ents and those from healthy women. In comparison, approximately 80 proteins were exclusive to one method or the other, many of which have previously been associated with cancer, including OC. These results demonstrate that the isolation methodology partially determines the protein identification results. Finally, functional assays showed that extracellular vesicles derived from the plasma of patients, isolated by either dUC or SEC, induced tumourlike characteristics in healthy ovarian epithelial cells, both in established cell lines and in primary cultures. Overall, this work integrates the analysis of circulating RNA, functional cellular models and the study of extracellular vesicles, providing a comprehensive approach for the identification and characterisation of novel biomarkers in OC.[Resumen] El cáncer de ovario es una de las neoplasias ginecológicas con mayor mortalidad, principalmente debido a la falta de biomarcadores fiables que permitan su detección precoz y opciones terapéuticas. En este contexto, esta tesis doctoral se planteó como objetivo el estudio de nuevos biomarcadores en muestras de plasma y su relevancia funcional, explorando su posible utilidad en biopsia líquida para el diagnóstico, pronóstico y monitorización de la enfermedad. Los niveles plasmáticos de HMGB1 y HMGB2 se determinaron mediante ensayos ELISA, pero no se detectaron diferencias significa􀆟vas entre muestras de pacientes y de mujeres sanas. El análisis en plasma de un panel seleccionado de lncRNAs, previamente identificados como asociados a OC en análisis de tejidos, identificó en estadios iniciales siete lncRNAs: EPB41L4A-AS1, MIR22, MIR100HG, ERVK13-1, UCA1, SPINT1-AS1 y ZNF232-AS1 con expresión más alta frente a muestras control, indicando su posible utilidad como biomarcadores para la detección precoz de la enfermedad. En estadios tardíos, MAGI2-AS3 y ZNF232-AS1 también mostraron una mayor expresión en el histotipo más frecuente, seroso de alto grado, mientras que para MIR100HG la expresión disminuyó. De forma complementaria, en líneas celulares de cáncer de ovario se llevaron a cabo estudios funcionales mediante la generación de modelos de silenciamiento estable de SPINT1-AS1 y ZNF232-AS1, comprobando su relación con proliferación, migración e invasión celular, tres características clásicas de los procesos tumorales. El aislamiento de EVs derivadas del plasma mediante diferentes metodologías demostró que la ultracentrifugación diferencial (dUC) y la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) son adecuadas y complementarias para este fin. Se identificaron 60 proteínas, independientes del método de aislamiento, y diferencialmente expresadas entre EVs procedentes de pacientes y EVs de mujeres sanas. Además, se identificaron aproximadamente 80 proteínas exclusivas de uno u otro tipo de aislamiento, muchas de ellas previamente relacionadas con el cáncer, incluido el cáncer de ovario. Los resultados obtenidos prueban que la metodología de aislamiento determina, en parte, los resultados de identificación de proteínas. Por último, ensayos funcionales demostraron que las EVs derivadas del plasma de pacientes, aisladas mediante dUC o SEC, indujeron características tumorales similares en células epiteliales sanas de ovario tanto en líneas establecidas como en cultivos primarios. En conjunto, este trabajo combina el análisis de lncRNA circulante en plasma, modelos celulares funcionales y el estudio de EVs aisladas de plasma de pacientes, ofreciendo un enfoque integral para la identificación y la caracterización de nuevos biomarcadores en el cáncer de ovario.[Resumo] O cancro de ovario é unha das neoplasias xinecolóxicas con maior mortalidade, principalmente debido á ausencia de biomarcadores fiables que permitan a súa detección temperá e á limitada eficacia das opcións terapéuticas actuais. Neste contexto, esta tese doutoral tivo como obxectivo o estudo de novos biomarcadores en mostras de plasma e a súa relevancia funcional, explorando a súa posible aplicación en biopsia líquida para o diagnóstico, prognóstico e monitorización da enfermidade. Os niveis plasmáticos de HMGB1 e HMGB2 determináronse mediante ensaios ELISA; porén, non se observaron diferenzas significativas entre as mostras de pacientes e as de mulleres sás. Pola contra, a análise en plasma dun panel seleccionado de lncRNAs, previamente identificado como asociado ao cancro de ovario en estudos de tecido tumoral, permitiu identificar en estadios iniciais sete lncRNAs (EPB41L4A-AS1, MIR22HG, MIR100HG, ERVK13-1, UCA1, SPINT1-AS1 e ZNF232-AS1) con niveis de expresión significativamente superiores en comparación cos controis, o que suxire a súa posible utilidade como biomarcadores para a detección temperá da enfermidade. En estadios avanzados, MAGI2-AS3 e ZNF232-AS1 tamén mostraron unha maior expresión no histotipo máis frecuente, o carcinoma seroso de alto grao, mentres que a expresión de MIR100HG apareceu diminuída. De forma complementaria, realizáronse estudos funcionais en liñas celulares de cancro de ovario mediante a xeración de modelos de silenciamiento estable de SPINT1-AS1 e ZNF232-AS1. Estes estudos demostraron a súa implicación na proliferación, migración e invasión celular, tres procesos clave asociados á progresión tumoral. O illamento de vesículas extracelulares (EVs) derivadas do plasma mediante distintas metodoloxías puxo de manifesto que a ultracentrifugación diferencial (dUC) e a cromatogra􀄰a de exclusión por tamaño (SEC) son técnicas adecuadas e complementarias para este fin. Identificáronse 60 proteínas, independentes do método de illamento, que se atopaban diferencialmente expresadas entre EVs procedentes de pacientes e EVs de mulleres sás. Ademais, identificáronse aproximadamente 80 proteínas exclusivas dun ou doutro método de illamento, moitas delas previamente relacionadas co cancro, incluído o cancro de ovario. Estes resultados evidencian que a metodoloxía de illamento condiciona, en parte, os resultados de identificación proteica. Finalmente, os ensaios funcionais demostraron que as EVs derivadas do plasma de pacientes, illadas mediante dUC ou SEC, induciron caracterís􀆟cas tumorais semellantes en células epiteliais ováricas sas, tanto en liñas celulares establecidas como en cultivos primarios. En conxunto, este traballo combina a análise de lncRNA circulante en plasma, modelos celulares funcionais e o estudo de EVs illadas do plasma de pacientes, ofrecendo unha aproximación integral para a identificación e caracterización de novos biomarcadores no cancro de ovario.