Estudio basal y dinámico de la fragmentación del ADN nuclear y mitocondrial en espermatozoides humanos

Abstract

[Resumen] La determinación de la fragmentación del ADN nuclear espermático (SDF-ADNn) aporta información adicional al diagnóstico reproductivo. La SDF está constituida por roturas de cadena doble (DSBs) y de cadena sencilla (SSBs). El test Sperm Chromatin Dispersion (SCD) permite determinar la SDF-ADNn global. Se diseñó una variante del test para estimar espermatozoides con DSBs y se estudió el número de copias de ADN mitocondrial por espermatozoide y su nivel de fragmentación (SDF-ADNmt), mediante PCR digital. Ello permitió analizar el comportamiento basal y dinámico post-eyaculación de estos parámetros. Las muestras de buena calidad mostraron niveles bajos de SDF-ADNn y de copias de ADNmt. Alrededor del 50% de estas copias estaban fragmentadas inicialmente, por lo que el número absoluto de copias no fragmentadas fue escaso. La incubación de muestras seminales con diferentes agentes tóxicos resultó en una mayor velocidad del daño progresivo en el ADN, demostrando la capacidad del estudio cinético para revelar daño críptico del espermatozoide. Las muestras de peor calidad revelaron mayores niveles basales y cinéticas más rápidas de SDF, predominando las SSBs, y sobre 3 veces más copias basales de ADNmt por espermatozoide. La SDF-ADNn global y número de copias de ADNmt se evidenciaron como factores independientes, discriminatorios de no-normozoospermia

[Resumo] A determinación da fragmentación do ADN nuclear espermático (SDF-ADNn) achega información adicional ao diagnóstico reprodutivo. A SDF constitúese por roturas de cadea dobre (DSBs) e de cadea sinxela (SSBs). O test Sperm Chromatin Dispersion (SCD) permite determinar a SDF-ADNn global. Deseñouse unha variante do test para estimar espermatozoides con DBSs e estudouse o número de copias de ADN mitocondrial por espermatozoide e o seu nivel de fragmentación (SDF-ADNmt), mediante PCR dixital. Iso permitiu analizar o comportamento basal e dinámico post-exaculación destes parámetros. As mostras de boa calidade amosaron niveis baixos de SDF-ADNn e de copias de ADNmt. Ao redor do 50% destas copias estaban fragmentadas inicialmente, polo que o número absoluto de copias non fragmentadas foi escaso. A incubación das mostras seminais con diferentes axentes tóxicos resultou nunha maior velocidade do dano progresivo no ADN, demostrando a capacidade do estudo cinético para revelar dano críptico do espermatozoide. As mostras de peor calidade amosaron maiores niveis basais e cinéticas máis rápidas de SDF, predominando as SSBs, e sobre 3 veces máis copias basais de ADNmt por espermatozoide. A SDF-ADNn global e número de copias de ADNmt se evidenciaron como factores independentes, discriminatorios de non-normozoospermia.

[Abstract] Determination of nuclear sperm DNA fragmentation (SDF-nDNA) provides additional information for the reproductive diagnosis. SDF contains double-strand breaks (DSBs) and single-strand breaks (SSBs). The Sperm Chromatin Dispersion test (SCD) allows the determination of the global SDF-ADNn. A variant of the test to estimate sperm with DSBs was designed and the mtDNA copy number per spermatozoon and its fragmentation level (SDF-mtDNA) were studied by digital PCR. This made to analyze the baseline and dynamic post-ejaculation behavior of these parameters possible. Good-quality samples showed lower SDF-nDNA and mtDNA copy levels. Approximately, 50% of the copies were initially fragmented, so the absolute unfragmented copy number was low. Incubation of sperm samples with different toxic agents resulted in a higher rate of progressive damage in the DNA, demonstrating the utility of the kinetic study in revealing sperm cryptic damage. Low-quality samples showed higher baseline SDF levels and faster kinetics, predominating the SSBs, and over 3 times more baseline mtDNA copy number levels. Global SDF-nDNA and mtDNA copy number were determined as independent and discriminatory factors of non-normozoospermia.