Desarrollo de un protocolo de PCR dúplex para la detección de cepas de Vibrio harveyi virulentas para peces

Abstract

[Resumen] Actualmente, el sector de la acuicultura juega un papel muy importante tanto en el suministro de alimentos como en la conservación de las especies marinas. El género Vibrio, un grupo de bacterias Gram negativas autóctonas de ambientes marinos, ejerce un impacto negativo sobre esta industria al causar importantes pérdidas económicas debidas a enfermedades conocidas como vibriosis. La lubina (Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758)) es una de las especies más importantes en la acuicultura mediterránea y la vibriosis causada V. harveyi (Vh) una de sus principales amenazas. Además, el cambio climático está produciendo un incremento en el número de brotes de esta vibriosis, así como un aumento en la virulencia de las cepas de esta especie. En el laboratorio de la Dra. Amaro se han recopilado evidencias que asocian este aumento en la virulencia con la adquisición de dos genes que confieren capacidad septicémica por transferencia genética horizontal. El objetivo de este estudio ha sido desarrollar y validar un protocolo de PCR dúplex que permitiera la detección de este patógeno en cualquier tipo de muestra y, al mismo tiempo, discriminase si la muestra contiene la variante más virulenta. Para ello, se ha desarrollado una PCR dúplex dirigida a dos genes diana, el gen toxR, marcador de especie, y el gen fpcrp, uno de los dos genes que confieren capacidad septicémica. Determinamos que el límite de detección de la PCR, tanto a partir de cultivos de laboratorio como de tejido de lubina infectado, era alto (105 células/mL), por lo que se introdujo un paso previo de enriquecimiento en agua de peptona alcalina (APA-1). Se ensayaron distintos tiempos de incubación y se concluyó que una incubación de 8 h en APA-1 reducía el límite de detección entre 4 y 3 unidades logarítmicas dependiendo de si se trataba de un cultivo de laboratorio o de tejido infectado. El procedimiento completo fue validado con muestras de campo en las que fuimos capaces de detectar Vh en el moco superficial y branquias de animales sanos, en su mayoría negativo para el marcador septicémico. En conclusión, este procedimiento podría ser implementado en las piscifactorías para controlar la emergencia de los brotes de vibriosis, especialmente si las variantes detectadas presentan el marcador septicémico.

[Abstract] Today, the aquaculture sector plays a very important role in both food supply and conservation of marine species. The genus Vibrio, a group of Gram-negative bacteria native to marine environments, has a negative impact on this industry as it is the cause of important economic losses due to diseases known as vibriosis. Sea bass (Dicentrarchus labrax (Linnaeus, 1758)) is one of the most important species in Mediterranean aquaculture and vibriosis caused by V. harveyi (Vh) is one of its main threats. In addition, climate change is causing an increase in the number of outbreaks of this vibriosis as well as an increase in the virulence of the strains of this species. In Dr. Amaro's laboratory, evidence has been gathered linking this increase in virulence to the acquisition of two genes that confer septicemic ability by horizontal gene transfer. The aim of this study was to develop and validate a duplex PCR that allows the detection of this pathogen from any type of sample and, at the same time, discriminates whether the sample contains the most virulent variant. To this end, a duplex PCR has been developed for two target genes: the toxR gene, a species marker, and the fpcrp gene, as septicemic marker. We determined that the limit of detection of this PCR from both laboratory cultures and infected sea bass tissue was high (105 cells/mL) so a pre-enrichment step in alkaline peptone water (APA-1) was introduced. Different incubation times were tested, and it was concluded that an 8h incubation in APA-1 reduced the detection limit by 4 to 3 log units depending on whether it was a laboratory culture or infected tissue. The whole procedure was validated with field samples in which we were able to detect Vh in surface mucus and gills of healthy animals mostly negative for the septicemic marker. In conclusion, this procedure could be implemented in fish farms to control the emergence of vibriosis outbreaks especially if the detected variants present the septicemic marker.