Development of alternative strategies for preservation and generation of corneal tissues for transplantation

Abstract

[Resumo] A queratoplastia ou transplante de córnea é o único tratamento dispoñible para moitas enfermidades corneais. Sen embargo, o acceso ás queratoplastias vese limitado pola dispoñibilidade das córneas doadas para transplante. Para incrementar o número de tecidos corneais, nesta tese investigáronse métodos de preservación de córneas alternativos e outras fontes de tecido corneal para queratoplastias. O primeiro obxectivo consistiu en analizar o efecto, en córneas humanas, de protocolos de criopreservación convencional con dimetil sulfóxido (DMSO) con (P1) e sen albúmina (P2), e de protocolos de vitrificación sen (P3) e con formamida (P4). O segundo obxectivo consistiu no desenvolvemento dun enxerto mediante enxeñaría de tecidos empregando membranas de Descemet como andamios e células endoteliais (CEs) para construír o endotelio. Tanto células como andamios procederon de córneas descartadas para o seu uso en clínica. Os resultados obtidos para o primeiro obxectivo mostran que só o P1 proporcionou córneas criopreservadas con CEs viables e unha estrutura xeral deformada. Sen embargo, a variabilidade dos resultados impide aplicar este protocolo na clínica. Os resultados do segundo obxectivo mostraron que é posible crear un enxerto a partir de córneas descartadas. Non obstante, a duración do estudio impediu que se crease un endotelio completamente funcional. Estas dúas prometedoras metodoloxías representan alternativas coas que, nun futuro, e tras máis estudos para a súa mellora, se podería reciclar e incrementar o número de tecidos corneais transplantables e mellorar o acceso ás queratoplastias.

[Resumen] La queratoplastia o trasplante de córnea es el único tratamiento disponible para muchas enfermedades corneales. Sin embargo, el acceso a las queratoplastias se ve limitado por la disponibilidad de las córneas donadas para trasplante. Para incrementar el número de tejidos corneales, en esta tesis se investigaron métodos de preservación de córneas alternativos y otras fuentes de tejido corneal para queratoplastias. El primer objetivo consistió en analizar el efecto, en córneas humanas, de protocolos de criopreservación convencional con dimetil sulfóxido con (P1) y sin albúmina (P2), y de protocolos de vitrificación sin (P3) y con formamida (P4). El segundo objetivo consistió en el desarrollo un injerto mediante ingeniería de tejidos empleando membranas de Descemet como andamios y células endoteliales (CEs) para construir el endotelio. Tanto células como andamios procedieron de córneas descartadas para su uso en clínica. Los resultados obtenidos para el primer objetivo muestran que sólo el P1 proporcionó córneas criopreservadas con CEs viables y una estructura general deformada. Sin embargo, la variabilidad de los resultados impide aplicar dicho protocolo en la clínica. Los resultados del segundo objetivo mostraron que es posible crear un injerto a partir de córneas descartadas. No obstante, la duración del estudio impidió que se crease un endotelio completamente funcional. Estas dos prometedoras metodologías representan alternativas con las que, en un futuro, y tras más estudios para su mejora, se podría reciclar e incrementar el número de tejidos corneales trasplantables y mejorar el acceso a las queratoplastias.

[Abstract] Many corneal diseases can only be treated through keratoplasty, a corneal transplantation whose access is dependent on the limited availability of transplantable donor corneas. To increase the number of corneal tissues, this thesis investigated alternative preservation methods and alternative sources of transplantable corneal tissues. The first objective was to investigate the effect, on human corneas, of cryopreservation protocols using dimethyl sulfoxide (DMSO) with (P1) and without albumin (P2), and of vitrification protocols without (P3) and with formamide (P4). The second objective was to engineer new transplantable tissues using Descemet’s membranes (DMs) and human endothelial cells (hECs) isolated from discarded corneas which were unfit for clinical use. Results showed that only P1 provided corneas with viable ECs and a slightly distorted general structure, but variability among C1-cryorpeserved corneas did not allow to use this protocol in the clinical practice. A corneal graft was successfully engineered using discarded corneas with an intact decellularized DM seeded with primary hECs. However, a fully functional endothelium was not observed within the timeframe used in this study. Consequently, additional research will be needed to improve both approaches for clinical applications. In the future and after further studies, these approaches would represent promising alternatives to improve the availability of transplantable corneal tissues and the access to keratoplasty.