Role of Connexin43 in Tumour Prograssion and Drug Resistance in BRAF-driven Tumors

Abstract

[Abstract] Mutations in the oncogenic serine/threonine protein kinase BRAF are casually involved in the onset and progression of several cancers, including more than 50% of cases of melanoma. Malignant melanoma is the most lethal form of skin cancer, with an increasing incidence worldwide. The most common BRAF mutation is a valine-to-glutamate transition (V600E), which results in constitutive activation of the kinase activity. BRAF and MEK inhibitors (BRAF/MEKi) combination have been approved for use in different cancers with BRAF mutations. Despite BRAF/MEK inhibition have shown efficacy for metastatic disease, acquired resistance remains the main barrier to increase progression-free survival and overall survival. Connexins (Cxs) are a family of transmembrane proteins that form hemichannels and gap junctions that permit the paracrine and direct intercellular communication by allowing the diffusion of ions, small molecules and metabolites. Alterations in connexin43 (Cx43) and gap junction intercellular communication (GJIC) have been implicated in tumour development and progression. However, due to the controversial role of Cx43 in melanoma progression, the aims of this project were to investigate the role of Cx43 in tumours with BRAF mutations and the mechanisms involved in acquired drug resistance to BRAF/MEKi. The results of this study demonstrate that Cx43 is poorly expressed in human melanoma and it is mainly localized in the cytoplasm. Cx43 overexpression, using a vector or small extracellular vesicles (sEVs) containing Cx43 significantly decreases in cell growth and proliferation and increases senescence and cell death by apoptosis in in vitro assays. We find that the effects on cell growth are independent of the channel activity. Post-translational modification such as SUMOylation of Cx43 detected in all human melanoma cell lines may affect protein stability, subcellular localization or protein-protein interactions. In fact, the presence of Cx43 in sEVs including exosomes, radically changes the content of proteins and small molecules of RNA (sRNA) in these vesicles, indicating that Cx43 may participate in the recruitment of proteins and sRNA. Indeed, the presence of Cx43 changes the composition and function of the released sEVs. In addition, the restoration of Cx43 in tumour cells with a mutation in BRAF significantly increases the efficay of BRAF/MEKi, and prevents drug resistance by reinforcing cellular senescence and increasing cell death by apoptosis. Importantly, double resistant cell lines do not contain Cx43, and the transfection with a vector to overexpress Cx43 or treatment with sEVs containing Cx43, re-sensitizes resistant cells to BRAF/MEKi. In this study we have identified Cx43 as a new therapeutic target for the treatment of tumours with BRAF mutations and to overcome drug resistance to BRAF/MEKi.

[Resumen] Mutaciones en la proteína serina/treonina quinasa BRAF se han asociado con el desarrollo y progreso de diferentes tipos de tumores. Más del 50% de casos de melanoma presentan mutaciones en el gen BRAF. El melanoma es un tipo de cáncer que se origina en los melanocitos y es el tumor de piel más letal. Mutaciones en el gen BRAF resultan en una activación constitutiva de su actividad quinasa, siendo la mutación más frecuente la transición de valina a glutamato (V600E). Los inhibidores BRAF combinados con inhibidores MEK (BRAF/MEKi) están resultando de gran utilidad en el tratamiento de tumores metastáticos. Sin embargo, un porcentaje importante de pacientes adquieren resistencia al cabo de 8-12 meses. En cáncer en general y, en melanoma en particular, la resistencia a los tratamientos, especialmente a los BRAF/MEKi, sigue siendo el principal obstáculo para aumentar la supervivencia global en cáncer. Las conexinas (Cxs) son una familia de proteínas transmembrana que forman hemicanales y uniones comunicantes que permiten la comunicación paracrina y directa entre células en contacto, mediante el intercambio de iones, metabolitos y moléculas pequeñas. Alteraciones en la conexina43 (Cx43) y en la actividad de las uniones comunicantes se han asociado tanto al desarrollo como al progreso de diferentes tipos de tumores. Hoy en día, todavía existe controversia en cuanto a la función de la Cx43 en el progreso del melanoma. Los objetivos de este proyecto se centraron en investigar la función de la Cx43 en tumores con mutaciones en BRAF y su potential implicación en mecanismos de resistencia a los BRAF/MEKi. Los resultados de este trabajo indican que los pacientes de melanoma expresan bajos niveles de Cx43 y que su localización es principalmente citoplasmática. El incremento en los niveles de la Cx43, utilizando un vector de expresion o vesículas extracelulares (sEVs) que contienen Cx43, desencadenan una disminución significativa en la proliferación celular y en la capacidad de formar colonias, así como un aumento en senescencia y muerte celular por apoptosis. La disminución en la proliferación celular resultó ser independiente de la actividad de los canales de conexina. Todas las líneas celulares de melanoma estudiadas muestran altos niveles de SUMOilación de la Cx43, que podría afectar a la estabilidad de la proteína, la localización subcelular o la interacción con otras proteínas. El análisis proteómico y de ARN-Sec demuestra que la presencia de la Cx43 en sEVs, incluidos exosomas, cambia radicalmente el contenido de proteínas y pequeñas moléculas de ARN en estas vesículas lo que indica que la Cx43 podría participar en el reclutamiento de proteínas y pequeñas moléculas de ARN. De hecho la presencia de la Cx43 en sEVs cambia significativamente la actividad de estas partículas en ensayos in vitro. La presencia de la Cx43 en tumores con mutación en BRAF aumenta significativamente la eficacia y evita la resistencia a los BRAF/MEKi cuando se restaura con un vector para sobreexpresar la proteína o las células tumorales son tratadas con sEVs positivas para la Cx43. Además, las celulas tumorales dobles resistentes (a BRAF/MEKi) pierden la expresión de Cx43, y la re-expresión de la proteína con un vector o con sEVs-Cx43 re-sensibiliza a estas células a los tratamientos con los BRAF/MEKi. En este trabajo de tesis hemos identificado a la Cx43 como una nueva diana terapéutica para el tratamiento de tumores con mutaciones BRAF y para evitar la resistencia a los BRAF/MEKi.

[Resumo] Mutacións na proteína serina/treonina quinasa BRAF asociáronse co desenvolvemento e progresión de diferentes tipos de tumores. Máis do 50 % dos casos de melanoma presentan mutacións no xen BRAF. O melanoma maligno é un tipo de cancro que se orixina nos melanocitos e é o cancro de pel máis letal. Mutacións no xen BRAF resultan na activación constitutiva da actividade quinasa, sendo a mutación máis común a transición da valina a glutamato (V600E). Os inhibidores BRAF combinados cos inhibidores MEK (BRAF/MEKi) están resultando de gran utilidade no tratamento de tumores metastáticos. Porén, un importante porcentaxe de doentes adquiren resistencia ó cabo de 8-12 meses. No cancro en xeral, e no melanoma en particular, a resistencia ós tratamentos, especialmente ós BRAF/MEKi, segue sendo o principal problema para aumentar a supervivencia global en cancro. As conexinas (Cxs) son unha familia de proteínas transmembrana que forman hemicanais e unións comunicantes que permiten a comunicación paracrina e directa entre células en contacto, ó permitir a difusión de ións e pequenas moléculas. Alteracións na conexina43 (Cx43) e na actividade das unións comunicantes están asociadas tanto no desenvolvemento como no progreso de diferentes tipos de tumores. A día de hoxe existe controversia en canto a función da Cx43 na progresión do melanoma. Os obxectivos deste proxecto centráronse en estudar a función da Cx43 en tumores con mutacións BRAF e a súa potencial implicación nos mecanismos de resistencia ós BRAF/MEKi. Os resultados deste estudo indican que os doentes de melanoma expresan baixos niveis de Cx43 e a súa localización é principalmente citoplasmática. O incremento nos niveis da Cx43, usando un vector de expresión, ou vesículas extracelulares (sEVs) que conteñen Cx43, desencadean unha diminución significativa na proliferación celular e na capacidade de formar colonias, ademáis dun aumento significativo na senescencia e na morte celular por apoptose. A disminución en proliferación celular resulta ser independente da actividade das canles de conexina. Todas as liñas celulares de melanoma estudadas presentan altos niveis de SUMOilación da Cx43 que poderían afectar a estabilidade da proteína, a súa localización subcelular ou as interaccións con outras proteínas. A análise proteómica e de RNAseq demostran que a presenza da Cx43 en sEVs, incluídos os exosomas, cambia radicalmente o contido de proteínas e pequenas moléculas de ARN nestas vesículas, o que indica que Cx43 pode participar no recrutamento de proteínas e pequenos ARN. De feito a presenza da Cx43 nestas vesículas cambia significativamente a actividade destas partículas en ensaios in vitro. A presenza da Cx43 en tumores con mutacións en BRAF aumenta significativamente a eficacia e evita a resistencia ós BRAF/MEKi cando se restaura cun vector para sobreexpresar a proteína ou se tratan con sEVs positivos para a Cx43. Ademáis, as células tumorais dobremente resistentes (os BRAF/MEKi) perden a expresión da Cx43, e a re-expresión desta proteína cun vector, ou o tratamento das células tumorais con sEVs positivas para a Cx43, re-sensibiliza a estas células ós tratamentos con BRAF/MEKi. Neste traballo identificamos a Cx43 como unha nova diana terapéutica para o tratamento de tumores con mutación en BRAF e para evitar a resistencia ós BRAF/MEKi.