Optimización de la producción heteróloga de la enzima α-galactosidasa de "Saccharomyces cerevisiae" a partir de residuos agroindustriales

Abstract

[Resumo]As α-galactosidasas son enzimas que actúan sobre os galactósidos presentes en moitas prantas que están destinadas á elaboración de alimentos e pensos. Polo tanto, o uso da actividade catalítica destas enzimas é de gran interese en moitas aplicacións biotecnolóxicas, especialmente naquelas dirixidas na industria alimentaria á degradación de oligosacáridos derivados da rafinosa (RFOs). Nesta Tese de Doutoramento propónse a caracterización enzimática e máis estudos de sistemas de produción heteróloga da enzima α-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae para avaliar as aplicacións de uso en procesos produtivos industriais. Confírmase que a enzima pertence ao grupo 1 de α-galactosidasas segundo a súa acción sobre galactomano-polisacáridos sintéticos e ten unha forte resistencia a proteasas acedo-neutras, calidade desexable industrialmente. A mellora xenética dunha cepa de S. cerevisiase e o uso dun sistema de expresión en Kluyveromyces lactis permitiu a produción da enzima a partir de residuos agro-industriais de difícil de reciclaxe, como as melazas de remolacha e o soro de leite. Empregouse a Metodoloxía de Superficie de Resposta (MSR) para levar a cabo a optimización estatística da produción da enzima utilizando medios de cultivo convencionais e medios alternativos máis sostibles, acadando os maiores resultados descritos ata agora expresados en termos de actividade α-galactosidasa extracelular. Finalmente, tendo en conta o interese actual pola reutilización e valorización deste tipo de subproductos da industria, realizáronse estudos de inmobilización enzimática empregando preparados enzimáticos a partir destas cepas recombinantes. O deseño de diferentes estratexias de inmobilización permitiu aumentar a estabilidade operativa de diferentes derivados da enzima que conleva a unha vantaxe adicional no seu campo de actuación segundo as necesidades do uso industrial.

[Abstract] α-galactosidases are enzymes that act on galactosides present in many plants that are destined to the elaboration of food and feed. It is for this reason that the use of the catalytic activity of these enzymes is of great interest in many biotechnological applications, especially those directed in the food industry to the degradation of oligosaccharides derived from raffinose (RFOs). In this Doctoral Thesis, studies of enzymatic characterization and systems of heterologous production of the α-galactosidase of Saccharomyces cerevisiae are proposed to evaluate the possibilities of its use in industrial production processes. Enzyme belongs to Group 1 of α-galactosidases according to the action on synthetic galactomano-oligosaccharides and has a strong resistance to acid-neutral proteases, an industrial desirable quality. Genetic improvement of a strain of S. cerevisiae and the use of an expression system in Kluyveromyces lactis allowed the production of the enzyme from agroindustrial residues of difficult recycling such as beet molasses and whey. The Response Surface Methodology (RSM) was used for statistical optimization of enzyme production using conventional and sustainable alternative culture media, reaching the highest results described so far expressed in terms of extracellular α-galactosidase activity. Finally, given the current interest in the reuse and valorization of this type of agroindustrial residues, studies of enzymatic immobilization were carried out using enzymatic preparations from recombinant strains. The design of different immobilization strategies allowed to increase the operational stability of different derivatives of the enzyme, which represent an additional advantage according to the needs of the industrial use.

[Resumen] Las α-galactosidasas son enzimas que actúan sobre galactósidos presentes en muchos vegetales que son destinados a la elaboración de alimentos y piensos. Es por ello, que el aprovechamiento de la actividad catalítica de estas enzimas es de gran interés en numerosas aplicaciones biotecnológicas, especialmente aquellas dirigidas, en la industria alimentaria, a la degradación de oligosacáridos derivados de la rafinosa (RFOs). En la presente Tesis Doctoral se proponen estudios de caracterización enzimática y sistemas de producción heteróloga de la α-galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae para valorar las posibilidades de su uso en procesos productivos industriales. Se confirma que la enzima pertenece al Grupo 1 de α-galactosidasas según la acción sobre galactomano-oligosacáridos sintéticos y presenta una fuerte resistencia a proteasas ácido-neutras, cualidad deseable a nivel industrial. La mejora genética de una cepa de S. cerevisiase y el uso de un sistema de expresión en Kluyveromyces lactis permitió la producción de la enzima a partir de residuos agroindustriales de difícil reciclaje, tales como las melazas de remolacha y el lactosuero. Se utilizó la Metodología de Superficie de Respuesta (MSR) para la optimización estadística de la producción de la enzima empleando medios de cultivo convencionales y medios alternativos más sostenibles, alcanzando los resultados más altos descritos hasta el momento expresados en términos de actividad α-galactosidasa extracelular. Finalmente, dado el interés actual en la reutilización y valorización de este tipo de residuos agroindustriales, se realizaron estudios de inmovilización enzimática utilizando preparaciones enzimáticas procedentes de dichas cepas recombinantes. El diseño de diferentes estrategias de inmovilización permitió aumentar la estabilidad operacional de diferentes derivatizados de la enzima que posibilita una ventaja adicional en su campo de acción según las necesidades del uso industrial.