Influence of aging on proliferation, pluripotency, immunogenic profiles from bone marrow mesenchymal stem cells

Abstract

[Resumen] Las células madre mesenquimales (CMMs) tiene una gran relevancia en la regeneración de tejidos mesenquimales como hueso y cartílago. El prometedor papel de las CMMs en terapia celular e ingeniería tisular parece estar limitado debido a la pérdida de potencial de regeneración con el incremento de la edad del donante. En esta investigación hemos tratado de entender como el envejecimiento influye en la capacidad de proliferación y pluripotencia en estas células y también en su potencial inmunogénico. CMMs de médula ósea procedentes de ratas Wistar de seis estadios de edad (neonato, infantil, juvenil, pre-pubertal, pubertal e adulto) fueron usadas en este estudio. Se llevo a cabo un ensayo proteómico cuantitativo usando iTRAQ 8-plex y las proteínas estadísticamente moduladas fueron agrupadas en tres procesos: pluripotencia, proliferación y metabolismo energético. Se midieron mediante citometría de flujo los marcadores de proliferación CD117 y Ki67. El análisis de los marcadores de pluripotencia Rex1, Oct4, Sox2 y Nanog usando reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real. Evaluación biológica mediante diferenciaciones dirigidas usando medios específicos de osteogénesis, adipogénesis y condrogenénesis durante 14 días, las células diferenciadas fueron analizadas usando técnicas histoquímicas. También se realizaron ensayos enzimáticos de varias enzimas como L-lactato deshidrogenasa y glucosa-6-fosfato isomerasa para validar los datos obtenidos del iTRAQ. Para profundizar en el estudio de las diferencias obtenidas a nivel proteómico hemos analizado el transcriptoma de los seis grupos de edad de CMMs de médula ósea usando Next Generation Sequencing. Un total de 9628 genes se encontraron modulados significativamente entre los grupos de edad y estos fueron agrupados en rutas metabólicas. Encontramos en los grupos juvenil, pre-pubertal y adulto una gran cantidad de genes diferencialmente expresados relacionados con inflamación mediada por la ruta de señalización de quimiocinas y citoquinas comparados con el grupo control. Además, las vesículas extracelulares de estos grupos de edad fueron aisladas y caracterizadas usando el análisis de tráfico de nanopartículas y citometría de flujo y la expresión de varios micro-ARNs relacionados con la ruta de interés, se evaluaron por qPCR-RT. El miR-21-5p fue estadísticamente significativamente alto en vesículas extracelular de CMMs del grupo pre-pubertal, mediante experimentos funcionales inhibiendo su expresión , investigamos la modulación del receptor tipo Toll 4 y los patrones moleculares asociados al daño. El envejecimiento afecta al perfil de proliferación, pluripotencia e inmunogénico de CMMs de médula ósea, También afecta la producción, contenido de micro-ARNs pro-inflamatorios y la efectividad de las vesículas extracelulares procedentes de células madre mesenquimales de médula ósea. Estos descubrimientos son importantes para entender la influencia del envejecimiento en las células madre mesenquimales y el avance en el desarrollo de terapias basadas en vesículas extracelulares de las mismas.

[Resumo] As células nai mesenquimais (CNMs) teñen unha gran relevancia na rexeneración de tecidos mesenquimais coma óso e cartilaxe. O prometedor papel das CNMs en terapia celular e inxenería tisular parece estar limitado debido a perda do potencial de rexeneración co incremento da idade do doante. Nesta investigación tratamos de entender coma o envellecemento inflúe na capacidade de proliferación e pluripotencia e no potencial inmunoxénica destas células. CNMs de medula ósea procedentes de ratas Wistar de seis estadios de idade (neonato, infantil, xuvenil, pre-púbere, púbere e adulto) foron empregadas neste estudo. Levouse a cabo un ensaio proteómico cuantitativo empregando iTRAQ 8-plex e as proteínas estadísticamente moduladas agrupáronse en tres procesos: pluripotencia, proliferación e metabolismo enerxético. Medironse empregando citometría de fluxo os marcadores de proliferación CD117 e Ki67. A analise dos marcadores de pluripotencia Rex1, Oct4, Sox2 e Nanog empregando a reacción en cadea da polimerasa a tempo real. A evaluación biolóxica mediante diferenciacións dirixidas empregando medios específicos de osteoxénesis, adipoxénesis e condroxénesis durante 14 días, as células diferenciadas foron evaluadas empregando técnicas histoquímicas. Tamén leváronse a cabo ensaios enzimáticos de varias enzimas coma L-lactato deshidroxenasa e glicosa-6-fosfato isomerasa para validar os datos obtidos do iTRAQ. Para profundizar no estudo das diferencias obtidas a nivel proteómico analizouse o transcriptoma dos seis grupos de idade das CNMs empregando Next Generation Sequencing. Un total de 9628 xenes atoparonse modulados significativamente entre os grupos de idades e estos foron agrupados en rutas metabólicas. Atopamos nos grupos xuvenil, pre-púbere e adulto una gran cantidade de xenes diferencialmente expresados relacionados coa inflamación mediada pola ruta de sinalización de quimiocinas e citoquinas comparadas co grupo control. Ademais, as vesículas extracelulares dos grupos de idade foron aisladas e caracterizadas empregando a análise de tráfico de nanopartículas e citometría de fluxo e a avaliación da expresión de varios micro-ARNs relacionados coa ruta de interese mediante qPCR-RT. O miR-21-5p foi estadísticamente significativamente alto nas vesículas extracelulares de CNMs do grupo pre-púbere, mediante experimentos funcionais, inhibindo a súa expresión, investigamos a modulación do receptor tipo Toll 4 e os patrones moleculares asociados ao dano. O envellecemento afecta ao perfil de proliferación, pluripotencia e inmunoxénico das CNMs de medula ósea. Tamén afecta a producción, contido de micro-ARNs pro-inflamatorios e a efectividade das vesículas extracelulares procedentes de CNMs de medula ósea. Estos descubrimentos son importantes para entender a influencia do envellecemento nas CNMs e o avance no desenvolvemento de terapias baseadas nas vesículas extracelularas das mesmas.

[Abstract] Mesenchymal stem cells (MSCs) are highly relevant for regeneration of mesoderm tissues such as bone and cartilage. The promising role of MSCs in cell-based therapies and tissue engineering appears to be limited due to a decline of their regenerative potential with increasing donor age. In this research we have studied and treated to understand how aging influences in proliferation and pluripotency capacities from these cells and also into their immunogenic potential. Six age groups from bone marrow mesenchymal stem cells of Wistar rats were studied (newborn, infant, young, pre-pubertal, pubertal and adult). Quantitative proteomic assay was performance by iTRAQ-8-plex and the proteins statistically significant modulated were grouped in pluripotency, proliferative and metabolism processes. Proliferation makers, CD117 and Ki67 were measure by flow cytometry assay. Real time polymerase chain reaction analysis of pluripotency markers Rex1, Oct4, Sox2 and Nanog were done. Biological differentiation was realized using specific mediums for 14 days to induce osteogenesis, adipogenesis and chondrogenesis and differentiated cells were analysed using histochemical techniques. Enzymatic analysis of several enzymes as L-lactate dehydrogenase and glucose-6-phosphate isomerase were done to validate iTRAQ data. To deeply study these differences we have analyzed by Next Generation Sequencing six age groups from bone marrow mesenchymal stem cells. A total of 9628 genes presented differences of expression among age groups and those genes were grouped into metabolic pathways. We focused our research in young, pre-pubertal and adult groups which presented the highest amount of genes differentially expressed related with inflammation mediated by chemokine and cytokine signalling pathway when compared with newborn group which was used as a control. Afterwards, extracellular vesicles from those groups were isolated and characterized by nanoparticle tracking analysis and flow cytometry and several micro-RNAs were checked by qRT-PCR because of their relationship with the pathway of interest. Since miR-21-5p was statistically significant highest in extracellular vesicles from mesenchymal stem cells of pre-pubertal group, we realized a functional experiment inhibiting it expression and investigating the modulation of Toll-Like Receptor 4 and their link to damage-associated molecular patterns. Aging affects proliferation, pluripotency and immunogenic profiles of bone marrow mesenchymal stem cells. Also its affects production, content of pro-inflammatory miRs and affectivity of bone marrow mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. These findings are important to the understanding about influence of the aging on mesenchymal stem cells and to advance in the development EV-based therapies.