Diferenciación "in vitro" de células madre aisladas de médula ósea ovina sobre biomateriales de colágeno y β-fosfato tricálcico

Abstract

[Resumen] El objetivo de este trabajo consistió en el aislamiento, cultivo, caracterización y diferenciación de células madre mesenquimales ovinas, para posteriormente cultivarse sobre biomateriales de Col1 y β-FTC con el fin de poder aplicarlas en un futuro en un modelo ovino de ingeniería tisular ósea. La población celular aislada de médula ósea y cresta ilíaca de oveja, se caracterizó por citometría de flujo para marcadores hematopoyéticos y mesenquimales, además, se valoró su capacidad de diferenciación celular(adipogénesis, osteogénesis y condrogénesis). Las muestras obtenidasse analizaron mediante técnicas de histoquímica e inmunohistoquímica. Los resultados se valoraron mediante un análisis semicuantitativo y estadístico. Caracterizadas las células madre ovinas se crecieron sobre biomateriales de Col1 y β-FTC induciendo su diferenciación a hueso. Se analizó su crecimiento y diferenciación a hueso mediante microscopía electrónica de barrido y transmisión, con un posterior análisis de energía de dispersión de rayos x. La población celular obtenida resultó homogénea y de aspecto fibroblástico. La caracterización fenotípica mediante citometría de flujo resultó positiva para CD29, CD44, CD166 y negativa para el resto de antígenos testados en este trabajo. La diferenciación celular mostró porcentajes bajos de tinción en los análisis histoquímicos llevados a cabo, tanto de adipogénesis como condrogénesis, siendo algo mayor en la osteogénesis. Se obtuvo crecimiento superficial sobre ambos biomateriales, con crecimiento interno únicamente en biomateriales de Col1, en donde también se aprecia diferenciación osteogénica temprana. Con los resultados obtenidos, si podemos determinar a día de hoy que la población celular aislada es una población de células madre mesenquimales y los biomateriales de Col1 y β-FTC son adecuados para el crecimiento celular. Se aprecia una mejor predisposición con respecto a ello en el biomaterial de Col1, pero sería necesario un mayor número de espécimenes que nos permitan obtener más resultados para la diferenciación de la población celular sobre ambos biomateriales y poder llevar a cabo estudios estadísticos.

[Resumo] O obxectivo de este traballo consistiu no illamento, cultivo, caracterización e diferenciación de células nai mesenquimais ovinas, para posteriormente cultivarse sobre biomateriais de Col1 e β-FTC co fin de poder aplicalas nun futuro nun modelo ovino de enxeniería tisular ósea. A poboación celular aislada de médula ósea e cresta ilíaca de ovella, caracterizouse por citometría de fluxo para marcadores hematopoiéticos e mesenquimais, ademais, valorouse a sua capacidade de diferenciacióncelular (adipoxénese, osteoxénese e condroxénese). As mostras obtidasanalizáronse mediante técnicas de histoquímica e inmunohistoquímica. Os resultados valoráronse mediante unha análise semicuantitativo e estatístico. Caracterizadas as células nai ovinas, creceronse sobre biomateriais de Col1 y β-FTC inducindo a súa diferenciación a hueso. Analizouse o crecemento e a diferenciación a oso mediante microscopía electrónica de barrido e transmisión con posterior análise de enerxía de dispersión de raios x. A poboación celular obtida resultou homoxénea e de aspecto fibroblástico. A caracterización fenotípica mediante citometría de fluxo resultou positiva para CD29, CD44, CD166 e negativa para o resto de antíxenos testados neste traballo. A diferenciación celular mostrou porcentaxes baixos de tinción nos análisis histoquímicos levados a cabo, tanto de adipoxénese como condroxénese, sendo algo mayor na osteoxénese. Obtívose crecemento superficial sobre ambos biomateriales, cun crecemento interno únicamente en biomateriais de Col1, onde también se aprecia diferenciación osteoxénica temprá. Cos resultados obtidos, si podemos determinar a día de hoxe que a poboación celular aislada é unha poboación de células nai mesenquimais e os biomateriais de Col1 e β-FTC son adecuados para o crecemento celular. Apreciase unha mellor predisposición con respecto a elo no biomaterial de Col1 pero sería necesario un maior número de doantes que nos permitan obter mais resultados para a diferenciación da poboación celular sobre ambos biomateriais e poder levar a cabo estudioestadísticos

[Abstract] The objective of this work is the isolation, culture, characterization and differentiation of ovine mesenchymal stem cells cultured on biomaterials Col1 and β-FTC in order to apply them in the future in an ovine model of bone tissue engineering. The isolated cell population of bone marrow and iliac crest of sheep was characterized by flow cytometry for hematopoietic and mesenchymal markers furthermore, its capacity for cellular differentiation (adipogenic, osteogenic and chondrogenic) was assessed. The samples were analyzed by techniques of histochemistry and immunohistochemistry. The results were assessed using a semiquantitative and statistical analysis. Characterized ovine stem cells were grown on biomaterials Col1 and β- FTC inducing their differentiation into bone. Growth and differentiation of bone were examined by scanning and transmission electron microscopy with a subsequent analysis of energy dispersive x-ray. The cell population obtained was homogeneous and fibroblastic appearance. Phenotypic characterization by flow cytometry was positive for CD29, CD44, CD166 and negative for other antigens tested in this work. Cell differentiation showed very low percentages of staining on the histochemical analyses conducted both adipogenic and chondrogenic, being somewhat higher in osteogenic. Growth on both biomaterials surface was obtained, with only ingrowth Col1 biomaterials. We were also observed early osteogenic differentiation. With the results, we can determine today that the isolated cell population is a population of mesenchymal stem cells and Col1or β-FTC biomaterials are suitable for cell growth. However we are not yet able to determine the biomaterials’s ability of bone regeneration. Predisposition better appreciated concerning that the biomaterial of Col1 but a greater number of donors that allow us to get more results for the differentiation of the cell population on both biomaterials and to carry out statistical studies would be necessary.